HDAC2通过调控Kv1.2参与神经病理痛

发布时间：2020-06-01 11:34

【摘要】：背景神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的,可引起患者长时间的痛苦,降低患者的生活质量,其临床特征为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛等。目前我们对神经病理性疼痛发展的分子机制并不十分清楚,临床上依然缺少有效的治疗手段,因此深入研究疼痛及镇痛的作用机制,将增加对疼痛本身的认识,对于新型镇痛药的研发,具有重要的理论和临床意义。钾离子通道是亚型最多、家族最为多样化的一类离子通道,研究证明背根神经节的电压门控钾离子通道是决定神经元放电频率和峰电位持续时间的关键因素。Kv1.2属于Kv1通透型亚型,在背根神经节中大量表达。周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛模型中,背根神经节神经元Kv1.2蛋白表达减少,电流下降,兴奋性增加,并出现疼痛。有关表观遗传修饰参与疼痛的研究越来越受到人们的关注。表观遗传指的是不改变基因组DNA的情况下,发生的一种可遗传修饰。组蛋白乙酰化修饰是其中一种重要的方式,主要由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)进行调节,二者在转录调控的表观遗传学机制中发挥着重要作用。HAT促使染色体的解聚,激活转录;而HDACs则封闭DNA,进而抑制转录过程。有研究表明,组蛋白乙酰化参与到了突触可塑性和慢性疼痛中,且组蛋白去乙酰化酶抑制剂在缓解炎症诱发的疼痛,内脏疼痛中也有着重要的调控作用。而去乙酰化酶抑制剂SAHA可以缓解大鼠神经损伤后的炎症反应和神经病理性疼痛,但HDAC的参与机制尚不清楚。因此,本研究建立了坐骨神经压榨性损伤模型(Chronic constriction injury,CCI),研究去乙酰化酶与Kv1.2基因的表达之间的关系,为临床更具针对性的药物研发提供新思路。目的本实验建立CCI大鼠神经病理性疼痛模型,检测术后大鼠的行为学变化以及HDAC1和HDAC2在术后0,3,7,14天的表达变化;通过给予去乙酰化酶抑制剂SAHA,发现大鼠行为学的改变以及Kv1.2的表达变化,验证去乙酰化酶是否与Kv1.2存在联系;通过免疫荧光双标检测HDAC1,HDAC2,Kv1.2在脊髓和DRG中表达部位以及HDAC1,HDAC2分别与Kv1.2的双标情况;接着利用细胞实验,在细胞中转染HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,检测对Kv1.2的表达有哪些影响,最后在体鞘内注射HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,检测行为学变化以及Kv1.2的表达变化,由此来进一步验证HDAC1或HDAC2对Kv1.2的调控作用。方法1.CCI模型建立及去乙酰化酶HDAC1,HDAC2的表达情况。大鼠麻醉,用碘伏消毒左侧后肢,暴露出大鼠左侧大腿中上1/3部位坐骨神经干,用玻璃分针游离出神经,用4-0手术丝线环绕神经干分别做4个轻度结扎环,间距大约1 mm。假手术组仅暴露坐骨神经而不结扎,其他步骤同手术组。分别检测两组术前1天,术后3天,5天,7天,14天的机械痛阈和热痛阈。并通过Western blot,qPCR等实验技术检测术后0,3,7,14天HDAC1,HDAC2的蛋白表达及mRNA的表达变化。通过免疫荧光技术检测HDAC1,HDAC2在DRG和脊髓的分布情况。2.给予去乙酰化酶抑制剂SAHA观察行为学变化以及Kv1.2的表达。雄性SD大鼠随机分为4组,CCI+vehicle,CCI+0.05μg/μL SAHA,CCI+0.1μg/μL SAHA,CCI+0.2μg/μL SAHA。在CCI后7天进行鞘内注射,连续给药7天,并在术前1天,术后3,5,7,8,9,10,11,12,13,14天进行机械痛阈和热痛阈的检测。取大鼠腰膨大区脊髓及术侧L_4-L_6的背根神经节,通过Western blot技术检测Kv1.2蛋白的变化。通过免疫荧光技术检测Kv1.2在DRG分别与HDAC1,HDAC2的共标情况。3.鞘内注射HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,检测痛行为及Kv1.2表达情况。首先在PC12细胞转染HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,并通过Western blot检测Kv1.2的表达。随后大鼠鞘内置管,待恢复进行CCI模型制作。手术分为5组:CCI,CCI+HDAC1 NC,CCI+HDAC1 siRNA,CCI+HDAC2 NC,CCI+HDAC2 siRNA。于术后7天注射相应的siRNA,并检测术后0,3,5,7,8,9,10,11,12天的行为学变化。取脊髓和DRG,通过Western blot检测Kv1.2的蛋白表达变化。结果1.在CCI诱导的大鼠神经病理痛模型中,HDAC1和HDAC2在DRG表达升高。CCI手术后,与sham组大鼠相比,手术组大鼠的机械痛阈和热痛阈在术后3d-14d显著降低(P0.001),但对侧机械痛阈和热痛阈与sham组相比没有显著差异,说明模型建立成功。之后通过Western blot检测脊髓HDAC1表达没有明显变化,而HDAC2表达在术后7,14天均有明显的上调(P0.05)。但是在背根神经节DRG,HDAC1在术后3,7,14天表达均显著上升(P0.01),HDAC2的表达也在术后7,14天升高(P0.01)。通过qPCR检测两者mRAN水平的表达,与蛋白表达结果一致。通过免疫荧光技术,发现HDAC1在脊髓主要表达在胶质细胞,在神经元的表达量很少。在DRG,HDAC1也仅仅表达在外围胶质细胞和少部分的中小型神经元中。而HDAC2在脊髓主要与神经元共标,在DRG,主要与大神经元共标,与中小神经元也有少量共标。2.鞘内注射去乙酰化酶抑制剂SAHA缓解大鼠痛敏,并反转了术后Kv1.2的下调。大鼠鞘内注射去乙酰化酶抑制剂SAHA,发现0.1μg/μL SAHA,0.2μg/μL SAHA可以显著缓解大鼠的机械痛敏和热痛敏。并且于术后14天取材,通过Western blot检测给药后脊髓和DRG中Kv1.2的蛋白表达变化,发现无论是脊髓还是DRG,CCI后Kv1.2表达降低(P0.01),而给予SAHA后,Kv1.2表达出现了明显的上调(P0.05)。通过免疫荧光双标技术,Kv1.2在DRG中同样主要表达在大神经元中,在中小神经元中的表达较少,而不与胶质细胞共表达。进一步双标发现,HDAC1不与Kv1.2共标,而HDAC2则基本与Kv1.2全部共标。3.鞘内注射HDAC2 siRNA缓解大鼠痛敏并增强Kv1.2的表达。体外试验中,将HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA转染到PC12细胞中,从细胞中提取蛋白质检测Kv1.2表达,发现只有HDAC2 siRNA可以使Kv1.2的表达上调(P0.05)。体内试验中,鞘内注射HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA后,测试机械阈值和热阈值。结果显示与CCI组相比,注射HDAC2 siRNA显著增加了大鼠机械痛阈和热痛阈(P0.05)。对侧机械痛阈和热痛阈没有显著差异。Western blot结果显示,相比CCI组,大鼠鞘内注射HDAC2 siRNA后,DRGs和脊髓中的Kv1.2蛋白水平显著增加(P0.05)。鞘内注射NC(阴性对照)组对Kv1.2水平没有影响。而注射HDAC1 siRNA后行为学及Kv1.2表达没有显著变化。结论在CCI模型大鼠DRG中,去乙酰化酶HDAC2表达升高,沉默HDAC2可以逆转由CCI引起的Kv1.2的低表达。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741

【参考文献】