CD30L在小鼠脑胶质瘤微环境中的作用机制研究

发布时间：2020-06-13 16:22

【摘要】：目的:在脑原位和转移性肿瘤中,肿瘤微环境是促进肿瘤发生发展的重要调节因素。通过免疫组织化学染色和流式细胞术分析发现,胶质瘤肿瘤微环境包括肿瘤细胞以及其他不同类型的非肿瘤细胞,主要有星型胶质细胞、周皮细胞、内皮细胞和多种免疫细胞。这些免疫细胞主要包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)、小胶质细胞、骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)和T细胞等,这些免疫细胞在特定条件下可以促进胶质瘤肿瘤微环境的形成,进而促进其生长和转移。CD30L属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员,主要表达在活化的T细胞和B细胞,还可以表达在巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells,DCs)的表面。CD30L可以促进霍奇金淋巴瘤的生长和增殖,同时作为免疫调节分子,参与多种自身免性疫疾病的病变形成,并发挥重要作用。以往有关CD30L与肿瘤的相关研究多局限在淋巴系或血液来源肿瘤范畴,而对于脑胶质瘤免疫微环境的形成,以及胶质瘤发生、发展的相关性研究目前尚属空白。因此,本课题利用Cd30l基因敲除小鼠(CD30LKO),颅内接种鼠胶质瘤细胞系-GL261建立胶质瘤模型,初步探讨Cd30l基因缺失对小鼠胶质瘤免疫微环境的形成及肿瘤进展的影响,为今后进一步深入研究CD30L在实体脏器肿瘤发生、发展中的作用机制提供重要的理论基础。研究方法:1、利用C57BL/6(wild-type,WT)、CD30LKO小鼠和尾静脉回输m CD30-Ig抗体的WT小鼠,颅内接种GL261胶质瘤细胞系建立小鼠胶质瘤模型,观察其生存率。2、通过免疫印迹的方法,检测正常WT小鼠脑组织、种瘤21天后WT小鼠癌旁组织和肿瘤组织内CD30L蛋白水平的改变;通过免疫荧光的方法,检测GL261细胞表面CD30L的表达;通过流式细胞术检测WT小鼠种瘤21天后,肿瘤浸润的TAM表面CD30L的表达。3、通过HE染色,观察种瘤21天后WT、CD30LKO和尾静脉回输m CD30-Ig抗体的WT小鼠脑组织病理改变,并且估算其胶质瘤的体积。4、通过流式细胞术,比较种瘤21天后WT和CD30LKO小鼠胶质瘤内的小胶质细胞、TAM和MDSC细胞亚群、细胞数量以及细胞功能性分子的变化。5、通过流式细胞术,比较种瘤21天后WT和CD30LKO小鼠胶质瘤内CD8+T细胞的表型和功能的变化。研究结果:1、在小鼠胶质瘤模型中,与WT小鼠相比,Cd30l基因缺失或CD30L分子阻断后,引起小鼠生存率下降。2、在小鼠胶质瘤模型中,与正常小鼠脑组织相比,胶质瘤肿瘤组织和癌旁组织中CD30L的表达量明显升高;GL261细胞系和胶质瘤浸润的TAM中表达CD30L。3、种瘤21天后,与WT小鼠相比,Cd30l基因缺失或CD30L分子阻断后,引起小鼠肿瘤体积增大。4、种瘤21天后,与WT小鼠相比,CD30LKO小鼠肿瘤浸润的小胶质细胞、TAM、CD45+CD11b-的细胞比例和数量增加;CD30LKO小鼠肿瘤浸润的TAM和MDSC亚群的细胞比例和数量增加;CD30LKO小鼠肿瘤内TAM和小胶质细胞的表型更加促进肿瘤生长。5、种瘤21天后,与WT小鼠相比,CD30LKO小鼠肿瘤浸润的CD8+PD-1+T细胞数量和比例明显升高,CD8+T细胞的增殖能力减弱,同时CD8+T细胞分泌的效应性细胞因子IFN-g和TNF-a的能力减弱,说明CD30L的缺乏引起CD8+T细胞的耗竭。结论:CD30L信号通过调节胶质瘤肿瘤微环境中浸润的免疫细胞、比例数量以及表型特征,在胶质瘤发生发展过程中,发挥重要的保护性作用。
【图文】：

中国医科大学硕士学位论文图 1. CD30LKO 小鼠促进胶质瘤的(A)通过免疫荧光检测 GL261 小鼠胶质瘤细胞系上 CD30CD30LKO 颅内接种 5×105GL261-EGFP 胶质瘤细胞系。通过流瘤相关巨噬细胞上 CD30L 的表达情况。(C)通过 WesternBlot 检瘤21天后癌旁组织(P) 和肿瘤组织(T)中的表达情况。并且通过灰(D) 向 WT、CD30LKO 和尾静脉回输 mCD30-Ig 抗体的 WT 小胶质瘤细胞系。观察各组种瘤后的生存率 (****,P<0.0001).(E)计和尾静脉回输 mCD30-Ig 抗体的 WT 小鼠肿瘤体积(***,P<0.001天后 WT 小鼠、CD30LKO 小鼠以及回输 mCD30-Ig 抗体的 WT分别为 50μm、2000μm 和 1000μm。

15图 3. CD30L 的缺乏促进胶质瘤内部免疫细胞的浸润(A) 在种瘤 21 天后，从 WT 和 CD30LKO 小鼠脑组织中提取浸润的免疫细胞，计算浸润的免疫细胞的细胞数量。(B) 通过流式细胞术检测 WT 和 CD30LKO 小鼠胶质瘤浸润的的免疫细胞的亚群，，圈出 EGFP-的细胞，进一步分析 TAM（CD45hiCD11b+）、小胶质细胞（CD45lowCD11b+）和 CD45+CD11b-细胞的比例和数量。数据均以平均数±标准差表示（n=5）。*,P<0.05;**, P<0.01; ***, P<0.001.
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41

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本文编号：2711434