快速GABA干预在细胞、亚细胞及受体水平抑制活体动物癫痫发作的机制研究

发布时间：2020-06-20 10:59

【摘要】：研究目的癫痫是临床上常见的一种慢性反复发作的中枢神经系统疾病。其特征主要表现为癫痫发作时脑内神经元异常同步化放电。癫痫反复发作会引起神经元损伤,导致多种脑功能障碍产生。目前主流观点认为,这种脑内神经元异常同步化放电的出现是由于兴奋与抑制失平衡所致。多种抗癫痫药物,通过增强脑内GABA受体介导的抑制作用,调节兴奋与抑制平衡,以达到抑制癫痫发作及减少脑损伤的目的。然而由于技术手段所限,增强GABA受体功能,抑制癫痫发作及脑功能损伤的作用机制还无法在活体动物细胞、亚细胞及受体水平进行研究。本课题应用双光子钙成像、光解笼锁、活体动物靶向及阴影膜片钳以及活体动物受体荧光标记等先进技术手段,观察快速GABA干预,抑制活体动物皮层单神经元痫样放电及胞体痫样钙信号、树突树突棘痫样钙信号以及延缓AMPA受体损伤等作用,在细胞、亚细胞以及受体水平,对增强GABA受体功能,抑制癫痫发作的机制进行研究。研究方法一、活体动物细胞水平快速GABA干预抑制痫样放电。(1)双光子阴影膜片钳电流刺激方法诱发活体小鼠皮层神经元高频动作电位发放。(2)双光子激光解笼锁(uncage)光敏感药物Rubi-GABA释放GABA。(3)钙荧光指示剂标记活体小鼠皮层神经元。(4)双光子显微镜观察活体小鼠皮层神经元胞体钙信号。(5)双光子显微镜引导细胞外贴付方法记录活体小鼠皮层神经元动作电位发放。二、活体动物亚细胞水平快速GABA干预抑制痫样钙信号。(1)双光子阴影膜片钳方法记录活体非人灵长类动物绒猴皮层神经元膜电位。(2)双光子钙成像技术观察绒猴及小鼠皮层神经元树突树突棘钙信号。(3)病毒转染方法在活体小鼠皮层神经元标记基因编码钙敏感蛋白。三、快速GABA干预延缓癫痫发作所致AMPA受体损伤。(1)子宫胚胎电穿孔技术(IUE)转染荧光标记AMPA受体以及神经元结构标记质粒。(2)双光子靶向及阴影膜片钳方法分别记录转染与未转染AMPA受体皮层神经元电生理指标以及突触传递功能。(3)双光子显微镜观察AMPA受体损伤变化。研究结果第一部分,双光子阴影膜片钳电流刺激诱发活体小鼠皮层单个神经元动作电位发放。双光子uncage技术实现活体小鼠皮层单细胞动作电位精准快速抑制。双光子显微镜引导细胞贴付记录方法,记录到致痫药物诱发的神经元动作电位频率增加以及GABA干预后动作电位被抑制。实验应用双光子钙成像技术观察到致痫药物诱发钙信号频率增加,幅值无明显变化以及GABA干预后痫样钙信号被抑制。第二部分,实验应用双光子阴影膜片钳记录到活体非人灵长类动物绒猴皮层神经元膜电位变化。双光子钙成像方法记录绒猴皮层神经元树突树突棘钙信号特点,并证明局部钙信号产生依赖于NMDA受体通道功能。双光子显微镜观察到致痫药物诱发的树突树突棘痫样钙信号发放以及快速给予GABA干预后,树突树突棘痫样钙信号被抑制。第三部分,实验应用双光子靶向及阴影膜片钳等方法证明子宫胚胎电穿孔方法转染外源性AMPA受体没有改变成年期动物活体细胞的电生理特性及其突触传递功能;应用双光子显微镜观察到荧光标记AMPA受体快速损伤变化及快速给予GABA干预延缓AMPA受体损伤。研究结论本论文应用双光子阴影膜片钳及uncage技术,成功实现活体小鼠皮层单细胞动作电位精准快速抑制。这一结果表明,双光子uncage抑制方法具有受体特异性选择干预;空间分辨率高,能够实现单细胞抑制;时间分辨率高,起效以及失效均迅速等诸多优点,为大脑局灶性癫痫精准快速及无副作用治疗提供思路。通过应用细胞贴付记录、钙荧光指示剂标记及双光子钙成像等方法,观察到GABA可以抑制活体动物皮层神经元痫样放电及痫样钙信号。通过应用基因编码钙敏感蛋白标记及双光子钙成像等方法,观察到快速GABA干预可以抑制活体动物皮层神经元树突树突棘痫样钙信号。结果表明,快速给予抑制性神经递质GABA,增强GABA受体介导的抑制作用,调节兴奋与抑制平衡,可以在细胞以及亚细胞水平抑制动物痫样电信号及钙信号,这可做为抗癫痫药物在活体动物细胞及亚细胞水平作用机制的直接证据。活体动物AMPA受体可视化技术使我们能够在活体动物水平观察到致痫药物诱发癫痫发作后AMPA受体的损伤变化以及GABA快速干预后损伤变化被延缓的现象。这一结果为癫痫发作的兴奋与抑制失衡理论提供了受体水平的实验证明,为今后癫痫的治疗方法探索以及抗癫痫药物靶点选择等研究提供重要的实验依据。非人灵长类动物模型对于人类各种疾病发病机制及治疗的研究具有重要意义。我们将阴影膜片钳以及树突树突棘水平钙成像技术推展到活体非人灵长类动物上,为非人灵长类动物细胞以及亚细胞水平的研究提供技术支持,也为在非人灵长类动物层面探讨癫痫发作机制进行初步探索。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1
【图文】：

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1.1.5.3 双光子激光扫描显微镜成像本部分实验，采用的双光子显微镜平台是日本尼康公司商用 NikonA1R MP型双光子显微镜系统，见图 1.1 左侧部分。其搭载一台 MaiTai DeepSee 双光子红外飞秒激光器（SpectralPhysics 公司，波长范围：690-1040nm，脉冲宽度 70fs，脉冲频率 80MHz），并配备有高速共振式扫描器（resonantscanner），高分辨率检流计式扫描器以及四通道 NDD 探测器（non-descanneddetectors）。显微镜成像软件为 Nikon NIS-Element C。对神经元胞体及其亚细胞结构树突进行成像时，采用 800nm 激光波长，40×0.8NA（数值孔径）水镜，512×512 像素，30 帧每秒扫描速度，视场为 200μm 200μm。根据成像深度调节激光功率（30-80mW）。5-10分钟成像时间窗内，没有出现明显的光损伤以及光漂白现象。每个细胞记录实验结束之后，显示出清晰的细胞胞体及树突树突棘形态结构。应用 Z 轴扫描系统，完成细胞三维成像。多细胞钙信号记录实验，根据成像需要每次记录 30-60 秒。

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图 1.1 课题实验室美国 axon 200B 膜片钳记录系统（左侧）以及日本尼康（Nikon）A1R MP 双光子显微镜（右侧）1.1.5.4 活体动物双光子阴影全细胞膜片钳记录（whole-cell recording）及细胞贴付记录（cell-attach recording）。全细胞膜片钳记录（whole-cell recording）：（1）小鼠固定于双光子记录平台下，记录槽内灌流人工脑脊液并通入混合气体（95% O2 / 5% CO2）提供氧气以及维持 PH 值。关闭实验室照明灯并将其余所有可见光源用两层红色过滤纸遮盖确保光敏感药物 Rubi-GABA 不会光解。记录电极内冲入含有 Alexa594 荧光指示剂的电极内液，给药电极加入含有 Rubi-GABA（200μM）的细胞外液（loading solution）。记录电极进入脑脊液前给予 20-30 mmpa 的正压，防止电极堵塞。给药电极进入过程中，均不给予正压。微操系统操控两侧臂并相对放置。（2）明场光源下（光源前方红色滤纸遮盖），应用 Nikon40×0.8NA 物镜调

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