五味子醇甲改善地塞米松对神经元损伤的机制研究

发布时间：2020-06-23 01:53

【摘要】：背景:研究表明,长期应激条件的刺激可以引起实验动物的异常行为并增加了人类患心理疾病的风险。除此之外,应激环境的慢性刺激会加速大脑老化,记忆力衰减并最终导致神经系统疾病的发生。糖皮质激素是下丘脑-垂体-肾上腺轴受应激刺激时分泌的主要激素,糖皮质激素类作为临床治疗药物在临床上的使用也非常广泛,尤其是用于对自身免疫性疾病和部分内分泌疾病的患者,这些患者均会有长期使用糖皮质激素的需求。研究表明应激激素皮质醇的升高和人类衰老过程中颞叶萎缩以及认知缺陷密切相关,另外临床数据表明伴有皮质醇水平升高的患者出现认知功能障碍和记忆衰退的症状早于同龄对照组患者。长期使用糖皮质激素类药物如地塞米松可损伤人类或啮齿类动物的记忆能力增加人体患神经退行性疾病的风险。临床数据发现神经退行性疾病患者(如阿尔兹海默尔症患者)体内皮质醇水平高于同龄组皮质醇平均水平,目前文献报道的长期使用糖皮质激素增加患神经退行性疾病风险的机制包括脑神经分泌因子的减少、氧化应激反应的出现,以及对神经细胞突起结构功能的改变。值得注意的是目前临床上尚没有发现有效对抗这种神经系统损伤的药物,一是由于中枢神经细胞具有不可再生性的特点;二是由于目前大部分被发现的具有神经保护性的物质都是大分子物质或者非脂溶性物质,无法通过血脑屏障。五味子(Schisandra chinensis,SCH)属于木兰科植物,五味子作为传统中药药材具有增强智力和改善心理的作用,常用于治疗病毒性肝炎、化学性肝炎以及心肌疾病。五味子发挥神经营养作用、抗氧化反应作用的主要成分是联苯环辛二烯木脂素。五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲是从五味子中提取的主要有效成分,通过结构分析得知五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲均是联苯环辛二烯衍生物。五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素作为小分子脂溶性物质可以通过血脑屏障,五味子中的这种小分子结构为其可作为神经营养作用药物提供了支持。从动物模型体内和体外的实验中证明,无论对由东莨菪碱引起的健忘症,淀粉样β样蛋白引起的神经毒性、顺铂诱导的氧化应激伤害还是基因表达异常引起的神经毒性,五味子醇甲表现有神经保护作用。文献报道五味子醇甲作为五味子果实中的主要活性成分具有安定、抗惊以及脑保护作用;然而,五味子醇甲对抗糖皮质激素所致的神经元损伤其可能的作用机制尚不明确。因此研究五味子醇甲在改善糖皮质激素所致的神经元损伤中的作用机制具有重要的研究价值。目的:通过体外实验探讨五味子醇甲是否对糖皮质激素所致的神经元损伤有保护作用,并发现其可能的作用机制,为临床治疗相关神经系统损伤提供理论依据。方法:实验从新生24小时以内的SD大鼠的脑组织皮层中提取神经元,体外培养3天,观察神经元突起生长状况;通过NSE实验和MAP2免疫荧光染色实验对提取的神经元进行鉴定,进一步确认神经元的形态及纯度,以及不同规格的培养皿的最优细胞种植密度;提取的神经元每三天换一次液,体外培养9天后,将神经元分为对照组和地塞米松处理组;用不同浓度的地塞米松(10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~-77 mol/L)继续作用神经元3天,MTT实验鉴定地塞米松处理过的神经元的活性;结合实时荧光定量实验PCR技术和免疫荧光染色技术,检测分组的神经元MAP2 mRNA的表达差异以及观察神经元突起的生长状态,最终确认实验中采取的地塞米松药物的适宜浓度。提取的神经元经过9天的体外培养后,将神经元分为对照组、地塞米松损伤组以及地塞米松损伤加不同浓度(40、80和160μmol/L)的五味子醇甲处理的实验组,继续培养三天;提取神经元的蛋白和RNA,通过western blot和实时荧光定量PCR以及免疫荧光实验探寻五味子醇甲对损伤的神经元可能的保护效应及机制。结果:1原代神经元经过3天的体外培养,根据观察到的神经突起生成情况,MAP2免疫荧光染色实验和NSE染色鉴定神经元的纯度和生长状态,发现接种神经细胞最优的密度为6孔板为100万/孔,12孔板为25万/孔,24孔板为8万/孔,96孔板为4万/孔。MTT结果地塞米松处理72小时后,10~(-4)和10~-55 mol/L的地塞米松处理组的神经元的存活率降低,MAP2抗体免疫荧光染色实验进一步显示神经元的突起在10~(-4)和10~-55 mol/L的地塞米松处理的情况下,神经元神经纤维缠结明显,部分神经纤维网络结构甚至崩解。所以确定有效的损伤浓度是10~(-4)和10~(-5)mol/L的地塞米松;在10~(-6)和10~-77 mol/L低浓度地塞米松处理浓度处理的情况下神经突起缠绕不明显,不能有效的损伤神经元。2神经元体外培养9天后,同时加入地塞米松和五味子醇甲,MTT实验结果显示神经元存活率降低;MAP2免疫荧光染色结果显示加入五味子醇甲后的神经元突起缠绕情况得到缓解,神经网络结构崩解情况较少。3 western blot实验检测神经元突触后致密蛋白的表达情况,结果显示与空白组和溶剂对照组相比,地塞米松处理组的神经元突触后致密蛋白PSD95的表达下调;tau蛋白的磷酸化水平增强,tau不同位点(ser199,ser202,ser396)的磷酸化水平升高;实时荧光定量PCR实验结果显示对空白对照组和溶剂对照组相比较,地塞米松处理组MAP2mRNA的表达量下降,葡萄糖转运体3(GLU3)mRNA的表达量下降。4在地塞米松作用神经元细胞的同时加入五味子醇甲作用细胞三天,Western Blot结果显示与地塞米松处理组相比,加入五味子醇甲后神经元细胞的突出后致密蛋白PSD95的表达增强,并表现为一定的五味子醇甲剂量依赖性,tau蛋白磷酸化水平降低,tau蛋白不同位点的抗磷酸化水平增强;实时荧光定量PCR结果显示,与地塞米松作用组相比较,五味子醇甲的加入可使神经元细胞MAP2 mRNA的表达量上调,葡萄糖转运体3的mRNA表达量增强。结论:五味子醇甲对糖皮质激素引起的神经损伤有一定的保护作用,其可能机制一是使神经元膜表面葡萄糖转运体3 mRNA的表达上调,加速葡萄糖的转运,为tau蛋白糖基化提供更多的底物,提高tau蛋白的糖基化水平,从而降低tau蛋白磷酸化水平;二是五味子醇甲通过增加突触周致密蛋白PSD95的表达量对神经元的突触有一定的保护作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：

糖皮质激素和记忆的倒U型剂量反应曲线图，虚线所指计量为最佳的巩固记忆的糖皮质激素水平，注意这个峰值可能会根据记忆的类型和阶段和个体差异而改变

图 2：糖皮质激素促进神经退行性疾病发生可能的慢性作用机制。五味子属有大约 30 个种类，五味子为其中的一种是多年生植物，主要生长在韩国东北地区、中国、日本以及俄罗斯的东部地区[15]。五味子是一个重要的药用植物，在统的药物中，五味子的果实一直被用于治疗多种机体功能紊乱症状，包括肾脏感染、

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本文编号：2726602