mTOR通过CD44活化Src促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长
发布时间：2020-06-26 20:03
【摘要】：中枢神经损伤后,如何提高神经元再生能力,促进轴突再生,恢复神经功能是世界一大医学难题。文献表明PI3K/PTEN/Akt/m TOR信号通路是调节中枢神经系统损伤后轴突再生的重要调节因子,对轴突的发生和延伸都有重要作用,但其作用机制不清。我们致力于寻找其下游与轴突再生相关的靶点。前期研究发现,CD44是m TOR调节轴突再生与生长锥形成的下游关键分子,查阅文献发现CD44与Src具有相关性,CD44沉默可以降低Src活性,且CD44沉默导致的树突形态的改变可因Src激活而恢复。基于以上背景,我们推测m TOR可能通过CD44调节Src活性进而促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。本研究选用SD大鼠乳鼠皮层神经元作为体外神经元模型。设计PTENsh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA沉默质粒,干扰神经元PTEN及CD44的表达。应用形态学与分子生物学技术阐明m TOR是否通过CD44活化Src促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。方法:原代培养SD大鼠乳鼠皮层神经元,首先采用PTEN sh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA干扰质粒转染皮层神经元,应用RT-PCR技术检测PTEN、CD44和Src m RNA表达的变化;应用Western blot技术检测PTEN,m TOR,CD44,Src蛋白水平的变化;其次在PTENi沉默后加入Src活性有效抑制剂(PP2),观察p Src蛋白水平的变化,明确体外培养的皮层神经元细胞中m TOR是否通过CD44调节Src活性。应用MTT法确定过氧化氢浓度,建立神经元氧化应激损伤模型。p Src免疫荧光染色观察PTENi组、PTENi+PP2组、PTENi+CD44i组损伤神经元p Src的表达。利用Phalloidin(鬼笔环肽)特异性染色标记肌动蛋白(F-actin),观察PTENi、PTENi+PP2、PTENi+CD44i干扰后损伤神经元生长锥及突起变化,以证明m TOR是否通过CD44活化Src,进而促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。结果:神经元生长3d时,转染PTENsh RNA,CD44sh RNA,PTEN+CD44sh RNA基因干扰质粒,筛选有效的干扰序列;运用RT-PCR和Western blot技术显示,PTENi沉默时,CD44,Src表达水平升高(P0.001);CD44i沉默时,CD44,Src表达水平均降低(P0.001);PTENi+CD44i双干扰时,m TOR表达水平升高,而PTEN,CD44,Src表达水平均降低(P0.001);PTENi组激活p Src,PTENi+PP2组和PTENi+CD44i组p Src活性与PTENi组相比显著降低(P0.001)。MTT法显示,200μM过氧化氢时,细胞存活率为60%,可以用于构建氧化应激模型。p Src免疫荧光染色显示,损伤神经元PTENi组,p Src在细胞内和生长锥末端表达较高,而sh NC组,PTENi+PP2组,PTENi+CD44i组p Src在细胞内(P0.01)和生长锥末端表达较少(P0.05)。F-actin标记的生长锥和突起统计学分析显示,损伤神经元PTENi组生长锥数目,面积和初级突起数明显高于sh NC组,PTENi+PP2组,PTENi+CD44i组(P0.05)。同时,Sholl分析显示,PTENi沉默,显著提高损伤神经元突起复杂程度(P0.001);损伤神经元PTENi组突起总长度和轴突长度明显高于sh NC组、PTENi+PP2组、PTENi+CD44i组(P0.01)。结论:mTOR通过CD44活化Src,进而促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：
图 1.1 PI3K/PTEN/Akt/mTOR 信号通路示意图2.3.1 抑制 PTEN,激活 mTOR 促进损伤神经元轴突再生一项近年来神经系统损伤后轴突再生研究的相关统计数据表明，越来越多的科研工作者将目光放在 PI3K/ PTEN/Akt/mTOR 信号通路提高神经系统损伤后再生能力机制上 。mTOR 是细胞蛋白质合成，增殖和生存的调节器[38,39]。 mTOR的合成代谢机制和分解代谢机制在轴突再生中起重要作用。在发育的大脑中，
图 1.2 神经元极化过程 微管（绿）和微丝（红）在轴突延伸过程中的分布神经系统损伤后轴突成功再生的判断条件是断端重构出新的生长锥。生长锥的再生是肌动蛋白动力学，包括生长锥肌动蛋白丝（F-actin）功能动力学，调节肌动蛋白结合蛋白（ABPs）和信号传导过程[64]。生长锥扩张是轴突向外延伸的必要条件，而轴突损伤后生长锥形成需要细胞各个方面综合调控。一个新的生长锥形成是生长锥形成相关蛋白在细胞局部的翻译。研究表明生长锥的再生可能与肌动蛋白相关蛋白，高尔基体相关蛋白，死亡相关蛋白激酶样激酶，c-Jun 氨基末端激酶，丝裂原活化蛋白激酶，Ran 结合蛋白，细胞因子转导信号抑制分子（SOCS3）、膜兴奋性、突触传递，神经突触内吞作用等等相关[65]。在轴突延伸期间，生长锥丝状伪足指明延伸方向。体外研究表明，丝状伪足的不对称延伸是轴突生长的基础[66]。生长锥尖端复合物的组成部分已经被鉴定，包括肌动蛋白结合蛋白，运动蛋白肌球蛋白 III，a1 整联蛋白[67]。前期实验表明，mTOR 通过 CD44 调节类神经元再生。查阅文献得知，CD4
本文编号：2730823
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：
图 1.1 PI3K/PTEN/Akt/mTOR 信号通路示意图2.3.1 抑制 PTEN,激活 mTOR 促进损伤神经元轴突再生一项近年来神经系统损伤后轴突再生研究的相关统计数据表明，越来越多的科研工作者将目光放在 PI3K/ PTEN/Akt/mTOR 信号通路提高神经系统损伤后再生能力机制上 。mTOR 是细胞蛋白质合成，增殖和生存的调节器[38,39]。 mTOR的合成代谢机制和分解代谢机制在轴突再生中起重要作用。在发育的大脑中，
图 1.2 神经元极化过程 微管（绿）和微丝（红）在轴突延伸过程中的分布神经系统损伤后轴突成功再生的判断条件是断端重构出新的生长锥。生长锥的再生是肌动蛋白动力学，包括生长锥肌动蛋白丝（F-actin）功能动力学，调节肌动蛋白结合蛋白（ABPs）和信号传导过程[64]。生长锥扩张是轴突向外延伸的必要条件，而轴突损伤后生长锥形成需要细胞各个方面综合调控。一个新的生长锥形成是生长锥形成相关蛋白在细胞局部的翻译。研究表明生长锥的再生可能与肌动蛋白相关蛋白，高尔基体相关蛋白，死亡相关蛋白激酶样激酶，c-Jun 氨基末端激酶，丝裂原活化蛋白激酶，Ran 结合蛋白，细胞因子转导信号抑制分子（SOCS3）、膜兴奋性、突触传递，神经突触内吞作用等等相关[65]。在轴突延伸期间，生长锥丝状伪足指明延伸方向。体外研究表明，丝状伪足的不对称延伸是轴突生长的基础[66]。生长锥尖端复合物的组成部分已经被鉴定，包括肌动蛋白结合蛋白，运动蛋白肌球蛋白 III，a1 整联蛋白[67]。前期实验表明，mTOR 通过 CD44 调节类神经元再生。查阅文献得知，CD4
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 ;Prognostic significance of PTEN,Ki-67 and CD44s expression patterns in gastrointestinal stromal tumors[J];World Journal of Gastroenterology;2012年14期
相关硕士学位论文 前1条
1 彭茹;mTOR信号通路通过CD44促进损伤类神经元突起生长的研究[D];吉林大学;2016年
本文编号：2730823
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/2730823.html
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