Hsa-circ-001193靶向结合miR-496调控胶质瘤细胞生物学行为的分子机制研究

发布时间：2020-06-29 22:16

【摘要】：胶质瘤是成人中枢神经系统中最普遍的原发性恶性肿瘤,具有复发率高、致死率高、预后差的特点。尽管目前国内外治疗胶质瘤采用手术后辅助放化疗的综合治疗方案,但是,绝大多数恶性胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的预后并没有得到显著改善。因此,深入研究胶质瘤发生和发展的分子机制对防治胶质瘤,提高患者生存期具有重要意义。胶质瘤的发生发展是一个复杂的多基因相互作用和多分子相互调节的过程。Circular RNA(circRNA,环状RNA)作为非编码RNA中的一颗新星,引发了越来越多国内外学者的关注,研究表明circRNA可充当竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),作为miRNA海绵吸附miRNA在转录和转录后水平调控下游目的基因的表达,进而参与多种肿瘤的生物学行为调控。MicroRNA是一组约22个核苷酸的单链非编码RNA,其通过与其靶基因mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合而负调控转录后的基因表达,进而参与多种细胞功能。MiR-496在肺腺癌中起到抑癌基因的作用,此外miR-496还参与乳腺癌的发生发展并与前列腺癌预后不良相关。RFX3(Regulatory factor X3)是调节因子X基因家族中的一员。研究表明,RFX3可结合FGF1的启动子区,调控促进FGF1的表达,进而调控细胞增殖和神经发生。此外,RFX3还能促进FGF8的表达,参与脑的早期发育。DEF6(又称Interferon regulatory factor 4 binding protein,IBP)在多种肿瘤中异常表达,并与骨外粘液软骨肉瘤、结直肠癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌的发生发展相关。本研究旨在阐明Hsa-circ-001193与miR-496、miR-496与RFX3、RFX3与DEF6之间的调控关系,以及对胶质瘤细胞的生物学行为的作用与分子机制。研究方法:首先培养人的胶质瘤细胞U87、U251,人正常星型胶质细胞,和人胚肾细胞HEK293。应用Real-time PCR检测Hsa-circ-001193、miR-496,应用Western blot检测RFX3和DEF6,在正常脑组织、胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞中的表达水平。应用CCK-8检测细胞增殖能力。采用Transwell检测细胞迁移和侵袭能力的变化。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。应用通过细胞转染方法构建Hsa-circ-001193、mi R-496、RFX3和DEF6过表达和表达沉默的细胞系。Real-time PCR方法检测Hsa-circ-001193、mi R-496、RFX3和DEF6的表达变化。Western Blot方法检测RFX3、DEF6、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表达变化。双荧光素酶基因报告系统检测miR-496和RFX3的靶向结合及结合位点。双荧光素酶基因报告系统和RNA免疫沉淀实验检测Hsa-circ-001193和miR-496的靶向结合及结合位点。应用染色质免疫共沉淀法检测RFX3和DEF6启动子的直接作用。裸鼠移植瘤实验检测Hsa-circ-001193和mi R-496对裸鼠移植瘤的生长和荷瘤裸鼠生存时间的影响。结果:Hsa-circ-001193在胶质瘤组织和细胞中内源性表达,且在胶质瘤组织和细胞中表达显著上调。沉默Hsa-circ-001193显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。MiR-496在胶质瘤组织和细胞中内源性表达,且在胶质瘤组织和细胞中表达显著下调。过表达miR-496显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。Hsa-circ-001193与miR-496存在靶向结合作用。沉默Hsa-circ-001193或过表达miR-496降低RFX3的表达。RFX3在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中内源性表达,且在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中表达显著上调。沉默Hsa-circ-001193通过负性调控miR-496,降低RFX3的表达,抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。沉默RFX3显著抑制U87和U251细胞的恶性生物学行为。RFX3与DEF6的启动子区结合,增加其启动子活性。DEF6在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中内源性表达,且在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中表达显著上调。沉默DEF6显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。过表达miR-496通过负性调控RFX3的表达,降低DEF6的表达,进而调控PI3K/AKT通路活性,调控胶质瘤细胞的恶性生物学行为。结论:1.Hsa-circ-001193、RFX3和DEF6在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中高表达,miR-496在胶质瘤组织和细胞中低表达。沉默Hsa-circ-001193、RFX3和DEF6,以及过表达miR-496抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为。2.Hsa-circ-001193靶向结合miR-496,miR-496负性调控RFX3的表达;RFX3与DEF6的启动子区结合,促进其转录,调节胶质瘤细胞的生物学行为。3.沉默Hsa-circ-001193与过表达miR-496的联合应用显著抑制裸鼠移植瘤生长,延长其生存期。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

【参考文献】