MRI精准引导白蛋白纳米声敏剂SDT治疗脑胶质瘤的实验研究

发布时间：2020-07-01 23:47

【摘要】：目的:设计并构建集磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)和声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)功能为一体的白蛋白纳米声敏剂HSA-Ce6-Mn,并研究其MRI引导下的脑胶质瘤SDT作用。方法:(1)以人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)包裹二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)合成HSA-Ce6,并以HSA-Ce6作为螯合剂螯合具有MRI成像功能的Mn~(2+),合成具有成像功能的SDT纳米声敏剂HSA-Ce6-Mn。利用透射电子显微镜及动态光散射粒径仪研究其形貌及粒径,并利用紫外分光光度计和荧光波谱仪分析HSA-Ce6-Mn的紫外吸收光谱和荧光光谱。为了探索使用HSA-Ce6-Mn作为T1加权MRI造影剂的可能性,在室温下用3.0T临床MRI扫描仪扫描具有不同Mn ~(2+)浓度的HSA-Ce6-Mn溶液,以计算其最终T1弛豫率(r1)值。2'7'-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)是一种高灵敏度的活性氧(reactive oxygen species,ROS)分子探针,用于测量超声辐照过程中HSA-Ce6-Mn介导产生的ROS水平。(2)采用荧光检测方法评价细胞内HSA-Ce6-Mn和Ce6的摄取量,以及联合超声处理后细胞内ROS水平的变化。然后,通过标准MTT和钙黄绿素-AM/碘化丙锭双重染色测定各组(HSA-Ce6-Mn+US组、HSA-Ce6-Mn组、Ce6+US组、Ce6组、US组和Control组)的细胞活性。(3)建立BALB/C无胸腺裸鼠胶质瘤模型,在不同时间点采集荧光图像和MRI图像。通过电感耦合等离子光谱发生仪确定血液的半衰期和24h组织分布。(4)将载有U87荷瘤小鼠随机分为4组研究合成HSA-Ce6-Mn联合高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasound,HIFU)治疗脑胶质瘤的疗效(HSA-Ce6-Mn+HIFU组、HSA-Ce6-Mn组、HIFU组和Saline组),绘制肿瘤生长曲线,评价体内抑瘤效果,标准颈椎脱臼法处死小鼠,收集肿瘤和主要器官,然后用HE染色,检测HSA-Ce6-Mn的生物安全性。(4)使用SPSS19.0统计软件进行数据分析,所有数值均用(Mean±SD)表示,采用单因素方差分析,用于多组间两两比较,P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)动态光散射测量表明,HSA-Ce6-Mn的平均流体力学直径为100±2.4nm,同时透射电子显微镜图像显示HSA-Ce6-Mn的平均直径为76±3.2nm,呈球形形态和均匀分布;HSA-Ce6-Mn和Ce6的荧光光谱没有差别,HSA-Ce6-Mn的紫外可见光谱与Ce6相似,但HSA-Ce6-Mn在660nm处波峰0.30(×10~5 a.u.)较相同浓度Ce6在660nm处波峰2.54(×10~5 a.u.)显著下降(P0.01);HSA-Ce6-Mn的r1值为12.2mM~(-1)S~(-1);荧光测定结果显示,随着照射时间和超声强度的增加,ROS水平增加,说明HSA-Ce6-Mn介导ROS的产量依赖于超声照射。(2)在细胞水平,荧光结果显示,与Ce6(1.00±0.16)相比,HSA-Ce6-Mn细胞内的归一化荧光强度(2.97±0.34)显著增强,二者有统计学差异(P0.01);HSA-Ce6-Mn+US组(2.84±0.07)的ROS水平显著高于Ce6+US组(1.00±0.20)(P0.01);当药物浓度达到20μg/L时,HSA-Ce6-Mn+US组(46.12±2.20)%的细胞活力显著低于Ce6+US组(65.01±3.05)%(P0.01),单一的声敏剂或超声处理只能在诱导部分细胞死亡,与之形成鲜明对比的是,HSA-Ce6-Mn+US组在破坏癌细胞方面非常有效并且表现出浓度依赖性;钙黄绿素-AM和碘化丙啶双重染色结果直观地表明HSA-Ce6-Mn+US组细胞死亡比例明显高于Ce6+US组(药物浓度20μg/L)。(3)在动物水平,实验结果显示,活体荧光成像显示游离的Ce6在神经胶质瘤组织中显示出相对较弱的荧光,注射后24小时,全身几乎没有荧光信号,相反,在尾静脉注射HSA-Ce6-Mn后,胶质瘤部位的荧光信号可在注射后3h与周围正常组织区域的荧光信号区分开来,24h瘤区荧光信号达高峰;MRI成像结果示,随着时间间隔的增加,小鼠的肿瘤T1信号增强;血液中的半衰期为0.98h,24h肿瘤组织内药物分布量较高;(4)对比于Saline组,HSA-Ce6-Mn组处理后的肿瘤,其生长不受抑制,HIFU治疗组中的肿瘤生长仅一定程度受到抑制,HSA-Ce6-Mn+HIFU治疗组可以极大地抑制治疗后肿瘤的生长。HSA-Ce6-Mn+HIFU组与其它组肿瘤体积差异显著(P0.01);此外,各治疗组均未见明显的体重减轻和明显的异常;生存曲线示HSA-Ce6-Mn+HIFU组小鼠较其它各组生存期延长,具有明显差异(P0.01);HE结果示,在Saline组及HSA-Ce6-Mn组癌细胞仍保持其正常形态,具有明显的膜和核结构。HIFU组显示出一段固缩细胞或细胞溶解,表明部分癌细胞被超声波破坏。HSA-Ce6-Mn+HIFU组大量癌细胞凋亡。各治疗组对裸鼠的组织脏器没有炎症及损伤。结论:本论文设计并构建了一种基于Ce6的纳米声敏剂,其结构简单、生物安全好,通过螯合Mn~(2+),可实现纳米体系内声敏剂与成像功能的有效整合,体内的肿瘤靶向递送,以及成像引导的SDT疗法的协同作用,为临床肿瘤联合治疗提供了一种新的思路与策略。
【学位授予单位】：三峡大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

示意图,示意图,材料合成,人血清白蛋白

三峡大学硕士学位论文1.3 实验方法1.3.1 材料合成及表征1.3.1.1HSA-Ce6-Mn 纳米声敏剂的合成将 80g 人血清白蛋白、50mM 谷胱甘肽溶解在 2mL 去离子水中，37℃反应 1h。加入 8mLCe6-乙醇溶液（已调整 Ce6 浓度为 2mg/mL），37℃搅拌 10min。之后，用12~14KDa 超滤管 4℃下去离子水中对悬浮液透析 12h 后，再与 MnCl2以 2：1 摩尔比混合 2h， 100KDa 超滤膜滤去过量的 Mncl2。HSA-Ce6-Mn 合成示意图见图 1 示。

效果图,体外超声,纳米药物,处理装置

三峡大学硕士学位论文3) 再次孵育 4h 后，每孔加入 20μLMTS 溶液，继续孵育 1h，酶标仪测。为检测纳米药物 SDT 治疗效应，实验包括 6 个分组：对照组（Control组（US 组）、二氢卟吩 e6 组（Ce6 组）、二氢卟吩 e6+超声组（Ce6+US声敏剂组（HSA-Ce6-Mn 组）和纳米声敏剂+超声组（HSA-Ce6-Mn+US 组胞存活率 = （各组 OD 值/Control 组 OD 值）× 100% 。

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