miR-130a调控靶基因HMGB2抑制胶质瘤增殖和EMT的分子机制研究

发布时间：2020-07-03 10:09

【摘要】：研究背景与目的脑胶质瘤是成人最常见的颅内原发性恶性肿瘤,目前各种治疗疗效均不理想。寻找和研究调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的相关基因将有助于进一步揭示胶质瘤的发病机理,为其基因治疗提供理想可靠的治疗靶标。microRNAs是一类长度为19-25个核苷酸内源性非编码的小分子单链RNA,研究表明,miR-130a可作为胶质瘤患者预后的预测指标。但其在胶质瘤中的体内功能及其作用机制尚未明确。高迁移率族蛋白-2属于HMG蛋白家族,其通过促进细胞增殖、侵袭和化疗耐药导致胶质瘤患者的预后差。本研究通过检测miR-130a在胶质瘤中的表达,并采用慢病毒构建miR-130a稳定过表达胶质瘤细胞株,检测细胞增殖、侵袭能力的变化以及EMT表型的改变,进一步探讨miR-130a介导的分子机制,同时研究EZH2抑制miR-130a转录的分子机制,为发现脑胶质瘤治疗新靶点提供依据。研究内容与方法1.胶质瘤中miR-130a基因表达特性的鉴定利用qRT-PCR检测胶质瘤细胞株及不同级别肿瘤组织中miR-130a的表达水平。2.miR-130a在胶质瘤中的功能初步研究用慢病毒构建miR-130a稳定过表达的胶质瘤细胞株将胶质瘤细胞U87中的miR-130a过表达,同时以si-Scrambled片段作为阴性对照。利用RT-PCR检测miR-130a过表达的效率。用噻唑蓝比色(MTT)实验检测miR-130a对胶质瘤细胞增殖功能的影响;运用平板克隆实验验证miR-130a抑制胶质瘤细胞克隆形成的能力;运用Boyden小室侵袭实验检测miR-130a可以抑制胶质瘤细胞的侵袭;采用裸鼠皮下成瘤实验验证miR-130a抑制胶质瘤细胞的增殖。3.miR-130a介导的分子机制初步研究miR-130a过表达后抑制了细胞的侵袭能力,故通过免疫荧光定性检测细胞侵袭相关的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、微丝蛋白的表达;通过Western blot定量检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达。由于过表达miR-130a后,细胞出现G1期向S期转化障碍并抑制细胞增殖,利用Western blot定量检测与细胞周期G1/S期相关的CDK4、c-myc、CyclinD1蛋白的表达。生物信息学软件预测HMGB2可能为miR-130a的直接靶基因,采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达miR-130a可以抑制HMGB2的表达;双荧光素酶报告基因验证miR-130a可以靶向结合HMGB2 mRNA的3'UTR区域进而抑制HMGB2基因的表达;MTT实验和克隆形成实验验证miR-130a通过靶向HMGB2抑制胶质瘤细胞的增殖;Boyden小室侵袭实验检测miR-130a通过靶向HMGB2来抑制胶质瘤细胞的侵袭。4.EZH2抑制miR-130a转录的分子机制研究利用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法检测细胞DNA甲基化水平;信息学分析EZH2可以结合miR-130a的启动子区域序列;染色质免疫共沉淀技术在体内进一步验证EZH2与miR-130a启动子区域结合;用RNA干扰技术将胶质瘤细胞U87中EZH2沉默表达,利用RT-PCR检测U87中miR-130a表达水平;进一步采用阿糖胞苷处理U87后检测miR-130a的表达水平。结果在胶质瘤中miR-130a的表达下调且过表达miR-130a能抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭能力。动物体内进一步验证了 miR-130a抑制胶质瘤细胞的增殖。生物信息学分析提示HMGB2 mRNA的3'UTR含有miR-130a直接作用的靶序列,双荧光素酶报告基因系统进一步验证该靶序列能与miR-130a结合,组织及细胞水平进一步验证miR-130a对HMGB2蛋白表达的调控发生在转录后水平;过表达HMGB2能逆转miR-130a对胶质瘤细胞恶性生物学行为的抑制。EZH2通过组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化(H3K27me3)来抑制miR-130a的表达。结论:miR-130a在胶质瘤中的表达降低;HMGB2介导了 miR-130a对胶质瘤恶性生物学行为的抑制,miR-130a的表达受EZH2调控。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：

胶质瘤,肿瘤组织,表达水平

荧光定量ＰＣＲ检测６２例胶质瘤肿瘤组织和１５例正常脑组织中ｍｉＲ－１３０ａ逡逑的表达水平，结果显示：与正常脑组织相比，胶质瘤组织组中ｍｉＲ－１３０ａ的表达水逡逑平低于正常脑组织（图１－２）。（纵坐标值代表２＿Ａａ值）逡逑＜0逡逑吾逦８－逡逑全逦？逡逑Ｅ逦Ｋ逡逑１－逦＋逡逑ｇ邋Ｓ逡逑１－Ｓ邋４－逡逑ｇ－ｉ逦N逡逑Ｉ逦0ｌ逦，逦十Ｘ逡逑Ｓ．逦ＮＢＣ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｒａｄｅ逡逑ＩＩ逦ＩＩＩ逦ＩＶ逡逑图１－２胶质瘤肿瘤组织中ｍｉＲ－１３０ａ的表达水平。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ａｓｓａｙ邋ｒｅｖｅａｌｅｄ邋ｔｈａｔ邋ｍｉＲ－１３０ａ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ逡逑ｄｅｃｒｅａｓｅｄ邋ｉｎ邋ｇｌｉｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ（ｎ＝６２）邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｂｒａｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅｓ（ｎ＝１５）．逡逑四、结论逡逑本节的研究发现ｍｉＲ－１３０ａ在胶质瘤肿瘤组织和细胞系中表达下调，逡逑ｍｉＲ－１３０ａ的表达与肿瘤的病理级别呈相关性。逡逑２４逡逑

稳定转染,细胞株,过表达,胶质

胞数铺到９６孔板中，然后分别在转染后１邋ｄａｙ、２邋ｄａｙｓ、３邋ｄａｙｓ、４邋ｄａｙｓ、５邋ｄａｙｓ、６邋ｄａｙｓ逡逑加入ＭＴＴ溶液，应用酶标仪检测其在４５０ｎｍ处的ＯＤ值，结果显示Ｕ８７中ｍｉＲ－１３０ａ逡逑过表达组在不同时间点的ＯＤ值均比对照组降低（图２－２），这表明ｍｉＲ－邋１３０ａ对胶质逡逑瘤细胞的生长有抑制作用。逡逑0邋－Ｉ邋ＬＶ－ｃｔｒｌ逦ＬＶ－ｍｉＲ－１３０ａ逡逑0邋－逦Ｊｇ，逡逑ＩＩ－逡逑Ｏ邋0逡逑ＣＴ３邋ｏ邋－逦＾逡逑0邋Ｉ逦，逦，逦，逦｜逦｜逦＾逡逑１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逡逑Ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｉｍｅ（ｄａｙ）逡逑４３逡逑

【参考文献】