EV71入侵人神经母细胞瘤细胞机制的初步研究

发布时间：2020-07-15 10:55

【摘要】：目的通过特异性的不同内吞途径化学阻断剂研究EV71入侵人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH机制，从而为探讨EV71感染神经系统损伤的致病机理提供实验依据，同时为临床抗病毒治疗及疫苗的研发开辟新的思路。材料与方法 1.病毒来源本实验所需的EV71，由重庆市疾病预防控制中心微生物检测所(病毒检测实验室)提供。 2.细胞来源本实验所需的肿瘤细胞即人横纹肌肉瘤细胞株（RD）由重庆市疾病预防控制中心微生物检测所(病毒检测实验室)提供。人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）由重庆医科大学附属儿童医院儿研所组织细胞培养室提供。 3.实验分组实验分为4组，有空白组、阴性对照组、氯丙嗪(Chlorpromazine,CPZ)处理组、制霉菌素（Nystatin,NT）处理组。CPZ处理组采用10、15、20μΜ药物；NT处理组给予10、15、20μg/ml的药物；对照组不作药物预处理；空白组不作任何处理。各组分别预处理SK-N-SH细胞1h，然后EV71病毒株感染靶细胞1h，最后细胞培养在含有阻断剂的相应的培养基中。24小时后，收集细胞，TaqMan荧光定量RT-PCR验证EV71mRNA的表达。 4.实验方法 4.1EV71病毒培养、增殖及滴度的测定。 4.2MTT法检测不同胞吞途径化学阻断剂对细胞增殖的影响。 4.3TaqMan荧光定量RT-PCR验证EV71mRNA的表达情况。结果 1.本实验成功地扩增出EV71病毒，病毒滴度为1×105TCID50。 2. MTT法检测到随着药物浓度梯度的增加，SK-N-SH细胞的增殖受到抑制。 3. TaqMan荧光定量RT-PCR结果表明SK-N-SH细胞易感于肠道病毒EV71型。 4. TaqManQPCR结果显示CPZ能够抑制EV71mRNA的表达（Ρ〈0.05），NT对其影响不大（Ρ〉0.05）。结论初步推测EV71入侵SK-N-SH细胞是通过网格蛋白依赖性的内吞作用入胞。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4
【图文】：

病毒感染,细胞,稀释度,比率

正常 RD 细胞出现 CPE 的 RD 细胞图 1 EV71 病毒感染 RD 细胞 24 h 后的 CPE(×100)Fig.1 The CPE of EV71 infecting RD cells after 24 h(×100).2 病毒滴度测定采用 Karber 法计算病毒滴度：病毒液稀释度出现 CPE 孔数出现 CPE 孔的比率10-18 8/8=110-28 8/8=110-38 8/8=110-48 8/8=110-57 7/8=0.875μ ｍ

病毒核酸,细胞发生,滴度

0.5)=1-1*（6.125-0.5）=-4.625.1ml4.625，接种 100μl，可使 50%的细胞发生病变。得病毒滴度为 1*104.625TCID50 检测 EV71mRNA 的表达果显示在 226bp 处可见 2 条清晰的条带，而阴性对照组带，证实 EV71 感染 RD 细胞可以扩增出 EV71 病毒特M 1 2 3 400

氯丙嗪,SK-N-SH细胞,细胞

浓度的氯丙嗪作用靶细胞 1h后，与对照组相比,药物组OD值降OD 值下降明显（Ρ=0.025；Ρ=0.000），根据公式计算出各浓度梯长的相对抑制率,发现 80μΜCPZ 对 SK-N-SH 细胞有明显的抑制学意义（Ρ=0.001）(见表 1.1，图 1.1)。表 1.1 氯丙嗪作用不同浓度各组细胞 OD 值（ x ±s,n=3）Tab.1.1 The OD value of cells functioned by different concentratioChlorpromazine（ ±,n=3）物分组浓度 OD 值 Ρ 值性对照组(PBS)100.91±0.140.88±0.11 0.734PZ(μΜ) 20 0.85±0.14 0.57240 0.63±0.16 0.02580 0.14±0.04 0.000

【参考文献】