异甘草素对缺氧环境下SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态的影响

发布时间：2020-07-16 18:31

【摘要】：目的:1.探讨二氯化钴模拟缺氧微环境对SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态及相关生物学行为(包括增殖、迁移)的影响。2.探讨异甘草素对缺氧环境下SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态及相关生物学行为(包括增殖、迁移)的影响。方法:1.第一部分实验:分别以不同浓度(100、200、400uM)Cocl2作用于SHG44胶质瘤细胞24h,采用三维培养检测胶质瘤细胞形成血管生成拟态能力,应用CCK-8法和划痕实验分别检测胶质瘤细胞增殖和迁移能力,采用Western blotting技术检测EphA2、MMP-2、VEGF等VM相关蛋白表达情况。2.第二部分实验:氯化钴模拟缺氧环境下,分别用低(20uM)、中(40uM)、高(80uM)浓度异甘草素处理SHG44胶质瘤细胞24h,采用三维培养检测胶质瘤细胞形成血管生成拟态能力;应用CCK-8法和划痕实验分别检测胶质瘤细胞增殖和迁移能力,采用Western blotting技术检测EphA2、MMP-2、VEGF等VM相关蛋白表达情况。结果:1.第一部分实验1.1与空白对照组相比,当二氯化钴浓度为100uM、200uM时VM数量、总长度增加,同时,细胞增殖活性及迁移距离增加,差异有统计学意义(P0.05);当氯化钴浓度达400uM时,VM数量、长度减少,细胞增殖活及迁移距离减小;差异具有统计学意(P0.05)。1.2Western blotting结果显示:与空白对照组相比,浓度为100uM、200uM的二氯化钴组EphA2、MMP-2、VEGF等VM相关蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义(P0.05);当氯化钴浓度达400uM时,EphA2、MMP-2及VEGF蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2.第二部分实验2.1与缺氧空白对照组比较,随着异甘草素浓度的增加VM数量、长度明显减少,细胞增殖活性及迁移距离减小,呈现一定的量效关系,差异具有统计学意义(P0.05)。2.2Western blotting结果显示:异甘草素可以抑制EphA2、MMP-2蛋白的表达,且呈一定的剂量依赖性,即随着异甘草素浓度增加,EphA2、MMP-2蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P0.05)。缺氧环境下,当异甘草素浓度为20uM、40uM时,VEGF蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。当异甘草素浓度达80uM时,VEGF蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.第一部分实验1.1微缺氧环境可诱导胶质瘤形成VM,同时细胞增殖、迁移能力增加;缺氧程度加重时可抑制VM及相关生物学行为(包括增殖、迁移)。1.2微缺氧可使胶质瘤细胞EphA2、MMP-2、VEGF等VM蛋白表达上调:缺氧程度严重时抑制EphA2、MMP-2、VEGF蛋白表达。2.第二部分实验2.1微缺氧环境下,异甘草素可抑制胶质瘤细胞血管生成能力及细胞增殖、迁移能力,其机制可能是通过下调EphA2、MMP-2、VEGF蛋白的表达。
【学位授予单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41
【图文】：

1-5 号管均有 50ul 混合液，6 号管中共 100ul。（4）7 号50ulPBS 缓冲液。（5）稀释后各 1-7 号 EP 管中标准品蛋50 ug/ml、625 ug/ml、312.5 ug/ml、156.25 ug/ml、78.12液：（1） 按照 BCA 试剂：CU=50:1 的比例配置所需工样品个数） 200ul/孔。（标准品个数=7；二氯化钴样品孔中加入 200ul 工作液（注拿 96 孔板时手避免接触板底（3） 向 7 个标准品孔中依次加入对应的 20ul 前期配好对应的样品蛋白各 20ul，轻轻摇晃 96 孔板使孔内液体混 30min。（4） 取出 96 孔板用酶标仪检测 562nm 处的吸准品蛋白 OD 值，y 为标准品蛋白浓度)做标准曲线（R2b= -0.3443（表 1）。（5）根据公式 y=2.1577x-0.3443，已样品蛋白浓度及上样量（上样量=20/蛋白浓度）（图 1）。

空白对照组细胞无规律生长序，排列紊乱，仅发现少数网状结构；Cocl2模拟的缺氧环境，当浓度为100uM、200uM时可形成较为完整的网状结构；其中，当Cocl2浓度为200uM时可形成典型的网状结构；当Cocl2浓度增加到400uM时网状结构基本消失。（图2）（3）Image软件计算各组VM 数量、长度（表2）：与常氧组对比，浓度为100uM和200uM Cocl2模拟的缺氧环境下，VM 数量、长度明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；当Cocl2浓度达400uM时VM 数量、长度较Cocl2浓度200uM时明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。图2 不同浓度氯化钴对SHG44胶质瘤细胞VM的影响（10 10）

细胞增殖能力呈剂量依赖性增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；当氯化钴浓度达 400uM 时，细胞增殖能力明显受到抑制，差异具有统计学意义（P<0.05）。（图 3）图3 不同氯化钴浓度对胶质瘤细胞增殖的影响2.3缺氧（不同氯化钴浓度）对SHG44胶质瘤细胞迁移的影响细胞划痕实验结果显示：与空白对照组相比， 100uM、200uM 的氯化钴组细胞迁移距离明显增加，呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P<0.05）；当氯化钴浓度达 400uM时，细胞迁移距离较 Cocl2 浓度 200uM 明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。（图4）

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本文编号：2758354