miR-149-5p通过靶向周细胞S1PR2受体减轻大鼠急性脑缺血再灌注后血脑屏障的通透性

发布时间：2020-07-16 23:36

【摘要】：目的:缺血性脑卒中后再灌注损伤引起的血脑屏障(BBB)破坏会加重水肿,引起进一步损伤,是卒中治疗中的一大难题。周细胞作为BBB的重要组成部分,可通过与其他组分相互作用调节BBB的结构和功能。以周细胞为靶点可能为卒中后BBB破坏评估和治疗提供新思路。方法:本研究采用SD大鼠短暂性大脑中动脉栓塞模型(t MCAO)模拟急性缺血性脑卒中及再灌注,通过侧脑室注射miR-149-5p的类似物149-agomir或抑制剂149-antagomir分别上调或下调脑梗死周边区(IBZ)miR-149-5p水平,采用改良的神经功能严重程度评分(m NSS)评估大鼠神经功能缺损情况,采用磁共振(MRI)显像和伊文氏蓝渗漏实验在体评估BBB通透性。腹腔注射鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR)2选择性受体拮抗剂JTE-013抑制S1PR2受体活性。体外采用糖氧剥夺/复氧模型(OGD/R)模拟缺血缺氧条件,采用S1PR2 si RNA敲除细胞S1pr2基因表达,使用miR-149-5p类似物mimic或抑制剂inhibior分别上调或下调体外培养的细胞内miR-149-5p水平。采用划痕实验和Transwell迁移实验检测周细胞的迁移能力,Transwell体系共培养大鼠原代脑微血管内皮细胞(BMECs)和脑周细胞建立体外BBB模型,通过测量跨内皮电阻(TEER)和FITC-葡聚糖通透率评估体外BBB模型的紧密型和通透性。实时-定量PCR(q RT-PCR)方法检测大鼠血清、IBZ脑组织和细胞内的miR-149-5p水平及相关基因m RNA表达水平。同时采用蛋白免疫印迹实验检测多种蛋白表达水平,免疫荧光共聚焦对S1PR2、PDGFR-β等进行定位。采用双荧光素酶实验验证S1PR2为miR-149-5p直接靶点。结果:我们发现,在体外OGD/R和大鼠tMCAO处理后,脑周细胞S1PR2的表达水平显著增加。MRI显像和伊文氏蓝渗漏实验发现,与溶剂对照组相比,S1PR2受体拮抗剂JTE-013可明显减轻t MCAO后大鼠BBB的渗漏;通过检测Transwell共培养体系的TEER和FITC-葡聚糖的通透率发现,减少周细胞S1PR2表达也可显著增加体外BBB模型的跨内皮细胞电阻,减少FITC-葡聚糖渗漏。同时,我们发现S1PR2可能通过NF-k B p65信号通路降低周细胞上N-钙粘蛋白的表达,同时促进周细胞迁移。此外,miR-149-5p在t MCAO大鼠IBZ、外周血和OGD/R处理后的周细胞中显著下降,其表达趋势与周细胞上Sl PR2表达呈负相关。双荧光素酶实验证实S1PR2为miR-149-5p直接靶点。我们进一步在体外BBB模型中发现,通过miR-159-5p类似物上调周细胞中miR-149-5p水平后,周细胞上N-钙粘蛋白表达水平显著增加,迁移能力减弱,BBB的通透性降低;而通过miR-159-5p抑制剂下调周细胞中miR-149-5p水平后,N-钙粘蛋白表达水平明显降低,迁移能力增强,BBB的通透性增加。同时,下调周细胞miR-149-5p水平所导致的N-钙粘蛋白表达水平的降低,迁移能力的增强和BBB的通透性增加均可通过下调周细胞S1PR2的表达所逆转。在t MCAO大鼠中,通过侧脑室注射agomir-149-5p上调miR-149-5p可减轻体内BBB通透性并显著改善t MCAO大鼠的神经功能结局,而下调miR-149-5p出现相反结果。结论:缺血再灌注早期周细胞上S1PR2受体表达增加,通过激活NF-k B p65信号通路减少N-钙粘蛋白表达水平,促进周细胞的迁移,从而加重BBB渗漏,加重损伤。miR-149-5p可通过直接靶向S1PR2减轻BBB通透性,改善神经功能结局。因此,我们推测,miR-149-5p可能成为缺血性卒中后评估和治疗BBB破坏的潜在靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
【图文】：

导致梗死核心扩大[1]。因此本实验主要关注在急性缺血再灌注后梗死周边区（IBZ）的变化（图1）。图 1 模式图和免疫荧光染色显示 tMCAO 大鼠 IBZ 部位 标尺=50 微米。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文首先为了检测急性缺血/再灌后脑内 IBZ 中 S1PR2 变化规律，我们采用 qRT-PCR检测 IBZ 中 S1PR2 mRNA 变化，结果发现 S1PR2 在 tMCAO 后 12h 开始表达增加，到第 1天达到高峰，持续增加至第 3 天，然后在第 5 天下降到正常水平（图 2A）。同时蛋白免疫印迹实验显示 S1PR2 蛋白表达呈现相同的变化趋势（图 2B）。

图 3 tMCAO 后不同时间点 IBZ 中周细胞 S1PR2 表达变化 假手术组和大鼠 tMCAO 后第12 小时、1 天、3 天、5 天和 7 天后脑切片 S1PR2 和 PDGFR- 双重免疫荧光染色。标尺=20μm。n≥6。

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本文编号：2758662