CXCR7参与调控海马区颗粒细胞的兴奋性突触传递及其对癫痫发作易感性的调节作用

发布时间：2020-07-20 15:02

【摘要】：第一部分CXCR7对海马齿状回颗粒细胞树突棘与突触可塑性的调节作用目的:主要探讨CXCR7对海马齿状回(dentate gyrus,DG)颗粒细胞树突棘与突触可塑性的影响。方法:1.通过免疫荧光技术检测CXCR7在C57BL/6小鼠海马DG区的表达与分布。2.构建携带有CXCR7-shRNA与CXCR7-过表达基因片段的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV);将AAV定点注射至C57BL/6小鼠海马DG区,拟干预CXCR7在DG区的表达。通过免疫荧光与免疫印迹技术验证CXCR7的干预效果。3.高尔基染色检测DG区颗粒细胞顶树突树突棘的数目与形态。4.透射电镜检测DG区兴奋性突触(excitatory synapses,ESs)的数目与结构的变化。结果:1.在小鼠海马DG区中,CXCR7在颗粒层有较为丰富的表达,且在颗粒层与NeuN+细胞共定位。2.免疫荧光结果提示AAV可以成功地转染至DG区颗粒细胞;免疫荧光与免疫印迹结果提示CXCR7-shRNA显著地抑制了CXCR7的表达;CXCR7-过表达显著地促进了CXCR7的表达。3.敲减CXCR7可以抑制树突棘的生长与成熟,即树突棘数目的减少与mushroom树突棘的比例降低;过表达CXCR7则促进了树突棘生长与成熟,即树突棘数目的增加与mushroom树突棘的比例升高;通过rescue实验(CXCR7-过表达)明显地减弱了CXCR7-shRNA对树突棘生长与成熟的负性调节作用。4.敲减CXCR7可以减少ESs的数目,缩短突触后致密物(postsynaptic density,PSD)的长度与厚度;过表达CXCR7则可增加ESs的数目,增加PSD的长度与厚度;rescue实验则明显减弱了CXCR7-shRNA对突触数目、PSD长度与厚度的负性调节作用。结论:CXCR7的表达变化可引起树突棘的生长与形态、ESs的数目与结构发生改变。第二部分CXCR7对海马齿状回颗粒细胞兴奋性突触传递功能的调节作用目的:第一部分研究发现CXCR7的表达变化引起了DG区颗粒细胞树突棘与ESs的数目与结构发生变化。因此,我们推测CXCR7对颗粒细胞的兴奋性突触传递具有调节作用。本部分将重点探讨CXCR7对海马DG区颗粒细胞兴奋性突触传递功能的调节作用。方法:1.AAV定点注射至海马DG区,干预CXCR7在DG区的表达。2.通过全细胞膜片钳技术检测颗粒细胞mEPSCs与PP evoked EPSCs(eEPSCs)的变化。3.通过免疫印迹技术检测NR2A与NR2B的表达情况。结果:1.敲减CXCR7减低了NMDAR mEPSCs的频率与波幅;过表达CXCR7则增高了NMDAR mEPSCs的频率与波幅;rescue实验明显减弱了CXCR7-shRNA对NMDAR mEPSCs的负性调节作用。CXCR7的敲减与过表达对AMPAR mEPSCs的频率与波幅均无显著影响。2.敲减CXCR7减少了NMDAR eEPSCs的波幅;过表达CXCR7则增加了NMDAR eEPSCs的波幅;rescue实验部分逆转了CXCR7-shRNA对NMDAR eEPSCs的负性调节作用。CXCR7的敲减与过表达对AMPAR eEPSCs无显著影响。3.敲减CXCR7减少了NR2A eEPSCs的波幅;过表达CXCR7则可以增加了NR2A eEPSCs的波幅;rescue实验部分逆转了CXCR7-shRNA对NR2A eEPSCs的负性调节作用。CXCR7的敲减与过表达对NR2B eEPSCs无显著影响。4.敲减CXCR7减少了细胞膜NR2A的表达水平,对总NR2A的表达水平无显著影响;过表达CXCR7增加了细胞膜NR2A的表达水平,对总NR2A的表达水平仍无显著影响;rescue实验减弱了CXCR7-shRNA对细胞膜NR2A表达水平的负性调节作用。CXCR7的敲减与过表达对NR2B膜蛋白与总蛋白的表达水平均无显著影响。结论:CXCR7促进了颗粒细胞NMDAR所介导的PP-evoekd的兴奋性突触传递活动,其主要影响NR2A所介导的突触传递活动。CXCR7可能通过促进细胞膜上NR2A的表达,进而增强NR2A所介导的兴奋性突触传递活动。第三部分CXCR7通过激活ERK1/2促进NR2A所介导的兴奋性突触传递活动目的:既往研究提示CXCR7在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中通过ERK1/2信号通路来发挥作用。因此,我们推测CXCR7可能也通过ERK1/2信号通路来调节NR2A所介导的兴奋性突触传递活动。本部分重点探讨CXCR7是否通过ERK1/2促进NR2A所介导的兴奋性突触传递活动。方法:1.AAV-CXCR7-过表达定点注射至海马DG区,促进CXCR7在DG区的表达。2.腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制剂SL327(50mg/kg),抑制小鼠脑组织中ERK1/2的磷酸化水平。3.通过全细胞膜片钳技术检测颗粒细胞PP-evoekd NR2A eEPSCs的变化。4.通过免疫印迹技术检测ERK1/2磷酸化水平与NR2A的表达情况。结果:1.CXCR7的表达水平与ERK1/2的磷酸化水平呈正相关:敲减CXCR7下调了ERK1/2的磷酸化水平;过表达CXCR7则上调了ERK1/2的磷酸化水平;rescue实验减弱了CXCR7-shRNA对ERK1/2磷酸化水平的负性调节作用。2.SL327显著减弱了CXCR7对ERK1/2磷酸化水平的上调作用。3.SL327显著减弱了过表达CXCR7对细胞膜NR2A表达的正性调节作用,提示CXCR7通过ERK1/2促进细胞膜NR2A的表达。4.SL327显著减弱了过表达CXCR7对PP-evoekd NR2A eEPSCs的正性调节作用,提示CXCR7通过ERK1/2促进NR2A所介导的兴奋性突触传递活动。结论:CXCR7通过激活ERK1/2促进NR2A所介导的兴奋性突触传递活动。第四部分CXCR7对癫痫发作易感性的影响目的:CXCR7对海马颗粒细胞兴奋性突触传递活动的影响提示其可能会影响癫痫发作易感性。因此,本节重点探讨CXCR7对癫痫发作易感性的影响。方法:1.收集颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)患者与对照组患者的脑组织。2.通过免疫印迹技术与免疫荧光技术检测CXCR7的表达情况。3.AAV定点注射至海马的DG区,干预CXCR7在DG区的表达。4.腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制剂SL327(50mg/kg),抑制ERK1/2的磷酸化水平。5.将局部场电位(local field potential,LFP)的记录电极植入海马,构建海人酸(kainic acid,KA)小鼠癫痫模型,记录并分析癫痫行为学与脑电的变化。结果:1.与对照组相比,CXCR7在KA小鼠癫痫模型海马组织中的表达水平上调。2.本研究共纳入9名对照组患者与9名TLE患者。与对照组患者相比,CXCR7在TLE患者脑组织中的表达水平上调。3.在KA小鼠癫痫模型中,敲减CXCR7可延长癫痫自发发作(spontaneous recurrent seizure,SRSs)潜伏期,减少SRSs次数,降低4-5级SRSs的比例,而过表达CXCR7则缩短SRSs潜伏期,增加SRSs次数,提高4-5级SRSs的比例。4.SL327减弱了过表达CXCR7对SRSs的正性调节作用。结论:CXCR7可提高癫痫发作易感性。抑制ERK1/2的磷酸化水平可以减弱过表达CXCR7对癫痫发作易感性的促进作用,提示CXCR7通过ERK1/2来调节癫痫发作易感性。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1
【图文】：

绿色,海马,转染,注射针

图 1-2. AAV 在小鼠海马 DG 区的转染效果：（A）AAV-GFP（绿色）被准确地注射到海马DG 区（白色箭头可见注射针痕迹），scale bar = 200μm；（B）AAV-GFP（绿色）广泛地转染至 DG 区颗粒层，scale bar = 100μm；（C）AAV-GFP（绿色）与 CXCR7（红色）、MAP2（紫色）阳性染色的细胞存在共定位（白色箭头），提示 AAV 成功转染至颗粒细胞。upper scalebar = 100μm，lower scale bar = 20μm.Figure 1-2. AAV with green fluorescent protein (GFP) in the hippocampal DG. (A) AAV wassuccessfully injected in DG, scale bar = 200μm. (B) GFP positive cells (green) were widelydistributed in DG, scale bar = 100μm. (C) AAV-GFP (green) co-expression was observed inCXCR7-positive cell (red), MAP2-positive neurons (purple), upper scale bar = 100μm, lowerscale bar = 20μm.

统计图,组间,统计图,荧光强度

图 1-3. CXCR7 在干预后的表达变化：（A）AAV 注射后第 4 周时，各组间 DG 区 CXCR7 荧光强度的差异（红色）以及各组间 MFI 的差异（右下统计图），scale bar = 100μm，n=5；（B-C）WB 检测 AAV 注射后第 4 周（B）与第 9 周（C）时，CXCR7 在各组间的表达差异, n=5. One-wayANOVA，*p<0.05，**p<0.01。Figure 1-3. Expression of CXCR7 after AAV injection. (A) Immunofluorescence analysis: themean fluorescent intensity (MFI) of CXCR7 observed in DG at week 4 after AAV injection,n=5, scale bar = 100μm. (B-C) WB analysis: the expression level of CXCR7 at week 4 (B) andat week 9 (C) after AAV injection, n=5. One-way ANOVA,*p < 0.05, **p< 0.01.2.3 CXCR7 对 DG 区颗粒细胞树突棘的调节作用本课题组通过高尔基染色检测各组间树突棘数目与形态的差异：颗粒细胞的顶树突伸入 DG 区分子层，分子层由内向外依次分为内、中、外分子层，其中外、

长度,组间,数目,比例尺

38图 1-5. CXCR7 的表达变化对 DG 区 ESs，SVs，以及 PSD 长度及厚度的影响。（A）各组 E的代表图，比例尺=200 nm。（B）各组 ESs 数目的统计分析（每 25μm2），n=3。（C）各组SVs 数目（单个）的统计分析，n=3。（D）各组间 PSD 长度的分析，n=3。（E）各组间 PS厚度的分析，n=3。ESs 的统计分析：one-way ANOVA；SVs 的数目、PSD 长度与厚度的分析：Kruskal-Wallis 检验；*p<0.05, **p<0.01。Figure 1-5. The quantitative analysis of ESs, SVs, PSD length and thickness. (A) Threpresentative electron micrographs of ESs, scale bar = 200 nm. (B) The statistical analysis the density of ESs, n=3 (the number of per 25μm2); (C) The quantitative analysis of th

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