多奈哌齐通过Src信号促进脑梗死后室管膜下区神经发生

发布时间：2020-07-21 13:39

【摘要】：背景及目的脑梗死是最常见的卒中类型,目前有效治疗的手段有限。研究显示,哺乳动物大脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ)的神经干细胞(neural stem cells,NSCs),在生理条件下处于相对静止状态,其在脑梗死后被激活,增殖并迁移至脑梗死区周围,可分化为成熟神经元以修复受损脑组织,提示SVZ神经发生可能是治疗脑梗死的重要靶点。我们前期研究证实,SVZ内表达胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)的神经元可调控脑梗死后SVZ神经发生。ChAT~+神经元主要通过乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors,AChRs)发挥作用,但其促进NSCs增殖的具体机制尚不明确。Src是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的上游信号,EGFR通路是NSCs增殖的经典信号通路之一。本研究通过应用多奈哌齐(胆碱酯酶抑制剂)上调小鼠脑内胆碱能水平,应用KX-01(Src特异性阻断剂)阻断Src信号通路,旨在探讨AChRs信号通路与Src及EGFR信号通路的关系,并分析脑梗死后Src在多奈哌齐促进SVZ内神经发生过程中的作用。实验方法将成年雄性昆明小鼠按随机数字表法分为假手术+溶剂组、脑梗死+溶剂组、脑梗死+多奈哌齐组和脑梗死+多奈哌齐+KX-01组。用线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞模型。模型成功24h后,灌胃给予同等体积的多奈哌齐(5mg/kg)、KX-01(1mg/kg)和生理盐水,每天一次,连续七天。用改良神经功能评分(modified Neurological Severity Scores,mNSS)评价tMCAO小鼠神经功能恢复情况,分值越大表明改良的神经功能恢复情况越差。采用Ki67标记增殖细胞,双肾上腺皮质激素(Double Cortin,DCX)标记神经母细胞,通过免疫荧光法观察各组小鼠SVZ内Ki67~+/DCX~+细胞的表达情况。应用Western blot方法测量各组小鼠SVZ中Ki67、p-EGFR、p-Raf、Src和p-Akt蛋白表达量的变化。先后使用重复测量和多因素方差分析各组间mNSS评分情况,单因素方差分析各组间免疫荧光各组新生神经母细胞数量及Western blot各蛋白表达量,组间比较采用LSD检验。P0.05认为差异具有统计学意义。结果1.脑梗死+多奈哌齐+KX-01组小鼠mNSS分值显著高于脑梗死+多奈哌齐组小鼠。2.免疫荧光结果显示,脑梗死+溶剂组小鼠SVZ内Ki67~+/DCX~+细胞数较假手术+溶剂组明显增多,脑梗死+多奈哌齐组Ki67~+/DCX~+细胞数较脑梗死+溶剂组和脑梗死+多奈哌齐+KX-01组显著增多。3.Western blot结果显示,脑梗死+溶剂组小鼠SVZ中Ki67、p-EGFR、p-Raf、Src和p-Akt表达量较假手术+溶剂组明显升高。脑梗死+多奈哌齐组上述蛋白表达量较脑梗死+溶剂组和脑梗死+多奈哌齐+KX-01组显著升高。结论1.胆碱能信号增强可促进脑梗死后神经功能恢复。2.胆碱能信号增强能够促进脑梗死后SVZ神经发生。3.多奈哌齐通过Src信号上调EGFR从而调控神经发生。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3
【图文】：

图 1 梗死组小鼠神经功能缺损评分表 1 各组小鼠 mNSS 评分差异（分, x±s）脑梗死+溶剂组(n=6)脑梗死+多奈哌齐组(n=6)脑梗死+多奈哌齐+KX-01 组(n=6)F 值/卡13.83±1.47 13.83±2.04 14.50±1.98 1.09012.50±2.07 9.33±2.50 12.00±2.83 2.810 10.17±1.94a6.33±2.58 10.33±3.08a4.631 9.00±2.00a4.83±2.32 9.00±3.29a5.165 1 改良神经功能评分法评价各脑梗死组小鼠神经功能恢复情况。在术后 1 天，脑梗鼠行为学评分差异无统计学意义；随后脑梗死+多奈哌齐组小鼠术后神经功能恢复明另外两组，与脑梗死+多奈哌齐组比较（aP<0.05）。脑梗死+溶剂组和脑梗死+多奈KX-01 组小鼠 mNSS 评分整体下降情况无统计学差异（P>0.05）。表 1 运用单因素方，各组在每个时间差异。

17天后，各组小鼠 SVZ 中 Ki67+/DCX＋细胞数（免疫荧光，，免疫荧光结果显示，各组小鼠 SVZ 新生神经母细胞数Z 新生神经母细胞数量定量分析，脑梗死+溶剂组 Ki67+显著降低，差异有统计学意义（aP<0.05）；脑梗死+多数较脑梗死+多奈哌齐组明显降低，差异有统计学意义（DCX＋细胞数较假手术+溶剂组明显增多，差异有统计学假手术+溶剂组；MCAO+Vehicle，脑梗死+溶剂组；M+D-01，脑梗死+多奈哌齐+KX-01 组。

p-EGFR,p-Raf,Src 和 p-Akt 表达量c，p-EGFR，p-Raf 和 p-Akt 蛋白光密度比较( x±+溶剂组=6)脑梗死+多奈哌齐组(n=6)脑梗死+多奈哌齐+KX-01 组(n=6)0.12ab1.39±0.23 0.84±0.26a0.15ab1.42±0.19 0.94±0.26a0.10ab0.88±0.13 0.73±0.15a0.12ab1.14±0.19 0.71±0.18a0.11ab1.04±0.19 0.81±0.19at 结果显示，各组小鼠 SVZ 中 Ki67,p-EGFR,p-Raf,，各组小鼠 SVZ 中 Ki67,p-EGFR,p-Raf,Src 和 p Ki67 蛋白表达量差异具有统计学意义（P<0.05）与假手术＋溶剂组比较，bP=0.000。各组小鼠 SVZ

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