Nrf2、NQO1在急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠海马区的表达及叔丁基对苯二酚对其干预的研究

发布时间：2020-07-22 21:22

【摘要】：目的:建立急性一氧化碳中毒迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)大鼠模型,叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)干预该模型,进行行为学病理学观察,检测脑海马区核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)及醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表达及相关性分析,探讨上述两种蛋白潜在的病理生理机制,为DEACMP发病机制的研究及疾病的治疗提供实验依据和参考。方法:1、选取180只正常清洁级健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,随机抽取120只用首剂+追加多次腹腔注射一氧化碳(carbon monoxide,CO)法建立DEACMP模型,余60只用同等方式方法注射空气作为空气对照组(AC组)。将DEACMP大鼠随机分为单纯一氧化碳中毒组(CO组)、一氧化碳中毒+tBHQ组(TC组)各60只,各组按染毒后1、3、7、14、21、28d作为监测点分为6个亚组,每个亚组10只。染毒后TC组予以每日一次腹腔注射tBHQ,AC组、CO组不做其他处理,实验期间大鼠自由摄食饮水。2、股动脉取血监测碳氧血红蛋白(HbCO)浓度,Morris水迷宫(morris water maze,MWM)实验测试大鼠染毒前与染毒后的学习记忆认知功能改变,验证是否造模成功及观察大鼠认知功能改变程度;HE染色观察大鼠海马CA1区细胞的病理学改变;Tunel染色观察大鼠海马CA1区细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测大鼠海马CA1区Nrf2及NQO1的表达,整个海马的NQO1表达用免疫印迹试验(Western Blot)检测。3、均数±标准差表示实验数据,用SPSS17.0统计软件分析数据。结果:1、成功建立大鼠DEACMP模型:(1)CO组、TC组大鼠中毒后不久即发生呼吸加速、活动减少、肢体乏力、精神萎靡症状,随着染毒次数增多一些大鼠发生大小便失禁、四肢强直抽搐,甚至丧失意识、死亡。存活的中毒大鼠表现出活动减少、烦躁不安、食欲减退等现象,AC组大鼠无明显变化;(2)Hb CO浓度监测:CO组、TC组大鼠股动脉血HbCO浓度50%,且维持时长16h;(3)MWM实验:在染毒前和染毒后7d三组大鼠的平均逃避潜伏期、平台象限活动时间/总时间的百分比差异在组间及组内比较均无统计学意义(P0.05)。与AC组相比,在染毒后14d、21d、28d,CO组、TC组大鼠平均逃避潜伏期延长、平台象限活动时间/总时间的百分比缩短,差异有统计学意义(P0.05)。与CO组相比,在染毒后21d、28d,TC组上述改变更明显(P0.05);(4)HE染色:AC组大鼠海马CA1区锥体细胞无明显异常,CO组、TC组大鼠海马CA1区锥体细胞均出现不同程度的病理改变,细胞排列紊乱,细胞数量变少,间隙增大,细胞水肿,细胞核固缩、碎裂,细胞变性、坏死等。2、Tunel染色:AC组大鼠海马CA1区细胞凋亡不明显,各监测点无明显差异(P0.05)。与AC组相比,各监测点中CO组、TC组细胞凋亡指数明显增加(P0.05),呈升高-高峰(7d)-下降的走势。与CO组相比,在染毒后1d、3d、7d,TC组细胞凋亡降低(P0.05),在染毒后21d、28d,TC组细胞凋亡增加(P0.05)。3、Nrf2及NQO1蛋白的表达:(1)免疫组织化学法:AC组大鼠海马CA1区Nrf2及NQO1的表达极少,各监测点无明显差异(P0.05)。与AC组相比,各监测点中CO组、TC组大鼠海马CA1区Nrf2及NQO1的表达均升高(P0.05),呈升高-高峰(3d)-下降的走势,各监测点中TC组均高于CO组(P0.05);(2)免疫印迹试验(Western Blot)表达趋势与免疫组化结果基本一致:AC组大鼠海马NQO1表达量较少,各监测点无明显差异(P0.05)。与AC组相比,各监测点中CO组、TC组大鼠海马NQO1/β-actin密度相对值均升高(P0.05),呈升高-高峰(3d)-降低的走势,各监测点中TC组均高于CO组(P0.05)。结论:1、首剂+追加的多次腹腔注射CO法是创建DEACMP模型的理想方法,具有操作简单、仪器常规、CO使用量少且易控制、安全、不污染环境、不浪费等优点。2、通过MWM实验比较大鼠染毒前后记忆及认知功能的变化,监测中毒大鼠动脉血HbCO浓度变化,结合中毒大鼠海马组织细胞的病理学及行为变化可初步判定是否成功建立DEACMP大鼠模型及大鼠高级认知功能损伤程度。3、tBHQ在迟发性脑病大鼠模型中能促进Nrf2核转位增加其表达从而上调下游靶蛋白NQO1的表达,前期(≤3d)表达升高发挥抗氧化、抗凋亡作用,后期(14d,21d,28d)两者持续过表达促进大鼠海马细胞发生迟发性凋亡,证明Nrf2/NQO1通路可能参与大鼠急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的发生。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R595.1;R747.9
【图文】：

结 果1 基本行为学改变让染毒后的大鼠在室温下空气流通处自由摄食饮水，所有大鼠染毒全程死亡 8 只，及时用备用鼠补足。解剖死鼠后可观察到充血水肿、颜色暗红甚至表面有小出血点的肝肠等脏器(见图 1-4)，与 AC 组相比存活的染毒大鼠摄食减少，精神欠佳，活动减少，反应迟钝。而AC 组大鼠染毒前后行为无明显变化。

结 果1 基本行为学改变让染毒后的大鼠在室温下空气流通处自由摄食饮水，所有大鼠染毒全程死亡 8 只，及时用备用鼠补足。解剖死鼠后可观察到充血水肿、颜色暗红甚至表面有小出血点的肝肠等脏器(见图 1-4)，与 AC 组相比存活的染毒大鼠摄食减少，精神欠佳，活动减少，反应迟钝。而AC 组大鼠染毒前后行为无明显变化。

图 1-2 染毒大鼠肢端口唇出现樱桃红Fig.1-2 Limbs far and lips cherry redof rats after poisoning图 1-4 染毒大鼠腹腔脏器充血水肿Fig.1-4 Abdominal viscera hyperemia edemof rats after poisoning2 染毒前后大鼠动脉血 HbCO 浓度动态改变用血气分析仪进行三组大鼠股动脉血的 HbCO 浓度检测，结果示三组大鼠 HbCO 浓度在染毒前均＜1%，初次染毒后 15min 大鼠脉血 HbCO 浓度攀升达 65%以上，而后呈现逐步下降走势，但在毒 2h 时仍高于 60%，4h 时降至 55%左右，此时追加半剂 CO 注射毒后测 HbCO 浓度继续攀升至 70%左右，而后再次出现下降走势

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本文编号：2766365