小鼠癫痫持续状态后髓过氧化物酶对血脑屏障通透性和癫痫复发的影响

发布时间：2020-08-13 06:30

【摘要】：目的探究癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)后血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性变化的时间模式以及髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)对BBB和自发性复发性癫痫(Spontaneous recurrent seizures,SRS)的影响。方法第一部分:选取雄性C57BL/6小鼠50只,随机分为癫痫组(n=45)和假诱导组(n=5),其中癫痫组经腹腔注射匹罗卡品诱导SE后,根据观察时间节点的不同分为:0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和30 d六组;假诱导组腹腔注射同等剂量的生理盐水作为对照。采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清标本;采用心脏灌注后断头取脑法收集脑组织标本;采用酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中S100β蛋白含量;采用免疫组化法检测脑组织中白蛋白的含量。血清中S100β蛋白含量和脑组织中白蛋白含量用于评估BBB的通透性,根据小鼠SE后不同时间节点蛋白含量的变化探究BBB通透性变化的时间模式。第二部分:选取雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为4-氨基苯甲酰肼(4-aminobenzoic hydrazide,ABAH)组(n=15)、生理盐水组(n=15)和假诱导组(n=10)。ABAH组小鼠腹腔注射匹罗卡品诱导SE后2小时腹腔注射MPO特异性抑制剂ABAH(40mg/kg),以后2次/日给药;生理盐水组在诱导SE后2小时腹腔注射同等剂量的生理盐水;假诱导组未使用匹罗卡品诱导SE的发生,余处理同生理盐水组。成功诱导SE 24小时后,选取诱导成功的生理盐水组、ABAH组和假诱导组小鼠各五只,采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清标本;采用心脏灌注后断头取脑法收集脑组织标本;采用酶联免疫法检测血清中S100β蛋白含量;采用免疫组化法检测脑组织中白蛋白的含量,评估ABAH对BBB通透性的影响。选取诱导成功的生理盐水组、ABAH组和假诱导组小鼠各五只,每日给药前1小时观察并记录小鼠癫痫首次发作的时间、每日发作的频率,评估MPO对癫痫复发的影响。结果1.小鼠在腹腔注射匹罗卡品4.5±2.2min后即出现面部无意识运动、尾部僵硬、冷汗淋漓以及全身震颤等癫痫1-2级发作;20.4±8.2min后出现癫痫3级及以上发作,如双侧前肢的肌阵挛、后肢站立以及姿势失控、跳跃、跌倒等表现。本实验用于诱导SE的小鼠共计75只,其中25只小鼠抽搐剧烈死亡,成功诱导SE小鼠50只,诱导成功率为66.7%。假诱导组小鼠在整个实验过程中无任何癫痫样发作。2.SE后,在不同时间节点测定小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组相比,SE后0小时癫痫小鼠血清中S100β蛋白含量即有明显升高(P=0.0022)。在SE后6 h、12 h、24 h小鼠血清中S100β蛋白含量均较假诱导组明显升高(P0.001)。此后小鼠血清中S100β蛋白含量有下降趋势,SE后48h小鼠血清中S100β蛋白虽然较假诱导组有显著升高(P=0.0085),但是较SE后24 h已有明显降低(P=0.0156)。SE后30 d,小鼠血清中S100β蛋白含量仍较假诱导组明显升高(P=0.0018)。3.SE后,在不同时间节点取小鼠的脑组织标本,行免疫组化染色示:在SE后0 h,小鼠颞叶和海马组织内即有阳性表达的白蛋白,散在分布于细胞内和细胞外。SE后6 h、12 h和24 h,小鼠颞叶和海马组织内白蛋白的表达量明显升高且呈上升趋势。至SE后48 h,小鼠脑组织内白蛋白的表达较前有所减少,呈下降趋势。4.SE后24 h,测定假诱导组、生理盐水组和ABAH组小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组比较,生理盐水组小鼠血清中S100β蛋白含量明显升高(P=0.0004);ABAH组小鼠血清中S100β蛋白含量也显著升高(P=0.0072);生理盐水组小鼠血清中S100β蛋白含量较ABAH组明显升高(P=0.0182)。5.SE后24 h,取假诱导组、生理盐水组和ABAH组小鼠的脑组织标本,行免疫组化染色示:在颞叶周围的血管内,均存在大量阳性表达的白蛋白颗粒,沿血管走形方向分布。其中,在假诱导组中,阳性表达的白蛋白局限在血管内,血管周围的颞叶组织只有极少量存在。而在生理盐水组中,虽然阳性表达的白蛋白主要存在于血管内,但是血管周围的颞叶组织内亦有大量存在。在ABAH组中,阳性表达的白蛋白主要分布在血管内,但血管周围的颞叶组织内也存在少量阳性表达的白蛋白颗粒。在海马组织中,生理盐水组白蛋白的表达量明显比假诱导组和ABAH组高。6.在后续的行为学观察中,生理盐水组和ABAH组所有成功诱导SE的小鼠均出现SRS。与生理盐水组比较,ABAH组SRS发生的时间延迟(180.8±3.544h vs 146.8±2.973h,P=0.0001),癫痫发作的频率降低(0.176±0.007/h vs0.34±0.018/h,P0.0001)。7.SE后30 d,测定假诱导组、生理盐水组和ABAH组小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组比较,生理盐水组小鼠血清中S100β蛋白含量明显升高(P=0.0018);ABAH组S100β蛋白含量未见明显升高(P=0.2819)。生理盐水组S100β蛋白含量较ABAH组明显升高(P=0.0187)。结论1.经腹腔注射匹罗卡品诱导SE后,BBB通透性的变化具有时间模式,至24 h BBB通透性的变化最为明显,可以作为SE发生后评估BBB通透性的重要时间节点。2.MPO特异性抑制剂ABAH可以降低BBB的通透性,同时延迟癫痫的复发时间,降低癫痫发作的频率,对癫痫发作具有治疗效应,表明MPO可能通过调节BBB的通透性参与SRS的发生,开发新的靶向于MPO的抗炎药物对癫痫的治疗具有重大意义。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.1
【图文】：

小鼠血清,节点,细胞外,免疫组化

SE 后不同时间节点小鼠血清中 S100β 蛋白的含量（与假诱导组比较，***P<0.001）疫组化结果 0h、6h、12 h、24h、48h 和 30d 分别取小鼠脑组织标本，免疫组化结果显示：在 SE 后 0h，小鼠脑组织内即有染成深褐箭头所示），散在分布于细胞内和细胞外，即阳性表达的白蛋组织中均有阳性表达。SE 后 6h、12h 和 24h，小鼠脑组织内显升高且有上升趋势。至 SE 后 48h，小鼠脑组织内白蛋白的，呈下降趋势。（图 2-2）0 h 6 h 12 h

免疫组化染色,节点,白蛋白,免疫组化

2-1 SE 后不同时间节点小鼠血清中 S100β 蛋白的含量（与假诱导组比较，** P<0***P<0.001）3 免疫组化结果SE 后 0h、6h、12 h、24h、48h 和 30d 分别取小鼠脑组织标本，行免疫色。免疫组化结果显示：在 SE 后 0h，小鼠脑组织内即有染成深褐色的颗质（箭头所示），散在分布于细胞内和细胞外，即阳性表达的白蛋白，在海马组织中均有阳性表达。SE 后 6h、12h 和 24h，小鼠脑组织内白蛋白量明显升高且有上升趋势。至 SE 后 48h，小鼠脑组织内白蛋白的表达较减少，呈下降趋势。（图 2-2）0 h 6 h 12 h

免疫组化染色,癫痫发作,小鼠,癫痫

图 3-2 在 SE 后 24 h，小鼠脑组织内白蛋白的免疫组化染色（40X）3.3.4 癫痫复发行为学观察结果成功诱导 SE 后，继续观察记录各组癫痫的复发情况。行为学观察发现：假诱导组小鼠自始至终无癫痫发作；生理盐水组所有小鼠均出现癫痫的自发性反复发作；ABAH 组所有的小鼠也均出现癫痫的自发性反复发作。与生理盐水组比较，ABAH 组小鼠癫痫发作的时间延迟（180.8±3.544hvs146.8±2.973h，P=0.0001），癫痫发作的频率降低（0.176± 0.007/h vs 0.34±0.018/h，P<0.0001）。癫痫发作时间是指每只小鼠从成功诱导 SE 后至首次发生癫痫的时间。癫痫发作频率是指每只小鼠在首次发生癫痫后，在随后的观察期间每小时癫痫发作的次数。（图 3-3，3-4）1 6 01 8 02 0 0RSonset(hour)P = 0 . 0 0 0 1

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