WNK3对替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞自噬影响的研究

发布时间：2020-08-14 21:08

【摘要】：目的:人脑胶质瘤来源于神经胶质细胞,是中枢神经系统中常见的原发肿瘤,恶性程度较高,往往可迅速扩散至远离原发灶的脑组织,且与周围脑组织浸润程度深,故手术很难将胶质瘤组织完全切除。目前,全世界范围内的胶质标准治疗方法为,手术切除,术后加以同步放化疗等综合治疗方法。在最新的世界卫生组织(WHO)关于中枢神经系统肿瘤的分类(2016)中首次将分子生物标记与典型的组织学特征结合起来,以定义不同的神经胶质瘤?新的神经胶质瘤诊断方法间接说明了对脑肿瘤生物学行为理解更深了一层?同时,胶质瘤患者个体化治疗被越来越重视,可能成为今后胶质瘤治疗的突破口。WNK蛋白激酶家族由四个成员组成,WNK1、WNK2、WNK3和WNK4,其特征在于保守催化结构域内的典型序列变异,因其功能结构域上缺乏赖氨酸而得名。尽管大多数研究都集中在WNK1,WNK3和WNK4在调节肾脏和肾外组织中不同离子转运蛋白中的作用,但越来越多的证据表明WNK激酶在与癌症相关的各种信号级联反应中发挥作用,它们在G1/S细胞周期进展、代谢性肿瘤细胞适应、逃避凋亡和转移中均发挥作用。然而,WNK在胶质瘤细胞自噬表型相关研究尚属空白。研究方法:在实验中,我们首先利用免疫组化检测到了WNK3在脑胶质瘤组织中的表达情况,同时也采用Western blot方法检测了WNK3在三种实验常用人脑胶质瘤细胞系U87、U251、U373的表达程度。随后,我们构建相关质粒进行“瞬转”,以达到干扰WNK3基因在U87细胞系中的表达的目的,并使用Western blot方法进行检验,观察WNK3基因是否下调。接着,我们使用WNK3干扰的U87细胞进行的细胞学功能学实验操作。使用CCK-8方法检测相同浓度的TMZ作用于不同组别,观察细胞存活率是否有明显差异。同时使用Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3B,P62,Beclin1。最后,使用透射电镜观测经替莫唑胺处理后的不同组别的胶质瘤细胞内部超微结构的改变。结果:实验结果显示,WNK3基因在U87、U251、U373三种胶质瘤细胞系中均有高低程度不同地表达。同时,在医院收集到的胶质瘤标本中,我们发现WNK3基因在高级别胶质瘤(GradeIII-IV)中的表达程度高于在低级别胶质瘤(Grade I-II)。通过WB方法检测,WNK3干扰后,经过替莫唑胺处理U87的细胞自噬相关蛋白较阴性对照的表达量低。另外,在TMZ的作用下,经CCK-8实验测得在0、24、36、48h细胞存活率,发现在WNK3干扰的U87细胞活性低于正常的U87细胞。我们还发现,经过替莫唑胺作用后的shRNA-WNK3 U87细胞,通过透射电子显微镜所见的双层膜结构及内含残余细胞器的自噬体和空泡单膜的自噬溶酶体较阴性对照组少。结论:以上实验结果表明WNK3干扰可减少替莫唑胺作用下胶质瘤细胞产生的自噬作用,可能通过自噬表型的改变来调节胶质瘤对化疗药物替莫唑胺的耐药性,可能是未来胶质瘤治疗方向中的作用靶点。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

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细胞系,质粒,对照组,吸光度

图 2 经质粒瞬转后，成功构建出 shRNA-WNK3 U87 细胞系，WNK3 表达量与对照组相比有明显降低3.3 CCK-8 法检测 WNK3 联合不同剂量替莫唑胺对 U87 增殖的影响为了探究 WNK3 对 U87 细胞化疗敏感性的是否有增强作用，我们采用不浓度梯度的 TMZ 进行 CCK-8 实验。WNK3 转染 U87 和质粒空转的 U87 细胞，在转染后8小时换全新含有不同剂量的TMZ ( 0, 50, 100, 200, 400uM)的DMEM培养基，作用时长达 24 小时，利用 CCK-8 法进行检测细胞活性，公式：细胞活性=[(试验孔吸光度-空白组吸光度) / (对照组吸光度-空白组吸光度)]*100%。CCK-8 结果显示(图 3), 空转+TMZ 组及 WNK3 干扰+TMZ 组剂量依赖性地抑制了 U87 细胞活性。同时，相比于对照组，WNK3 干扰组中 TMZ 诱导细胞活性明显低于空转对照组。证明了转染 WNK3 后，可大大增强 TMZ 对胶质瘤 U87细胞增殖抑制作用。

情况,吸光度,对照组,转染

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