PGD2-DPs途径通过调控自噬参与糖尿病脑损伤机制

发布时间：2020-09-24 10:59

　　糖尿病是一种常见的以高血糖为主要特征的代谢紊乱疾病,主要以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)为主。近年来,T2DM的患病率正在不断提高。T2DM会造成全身多器官损伤的并发症,已成为致残和致死的主要原因,其中T2DM引起的脑损伤越来越受到关注。但是,T2DM引起的脑损伤的机制仍不清楚。因此,对T2DM引起的脑损伤的发病机制进行深入的探讨,将有助于寻找合适的治疗策略或新药研发。自噬是细胞内的基本生物学过程,对维持细胞内稳态,保持机体健康起着重要作用。自噬不仅能抑制炎症因子的产生,降低氧自由基,抑制细胞凋亡,并能为细胞器的更新提供原料。因此,自噬调节可能是一个安全有效的策略以防治T2DM引起的脑损伤。COX2已经被证明参与多种急慢性神经损伤,COX2抑制剂可能是改善糖尿病认知功能障碍的有效药物。考虑到糖尿病是一种慢性疾病,糖尿病脑损伤的防治需要长时间给药,长时间使用COX2抑制剂会导致心脏、肾脏等严重副作用,因此COX2下游的前列腺素及其受体可能是糖尿病脑损伤防治更合适的靶点。PGD2是脑中含量最多的前列腺素,其通过受体DP1和DP2发挥作用。DP1和DP2在不同病因导致的损伤中作用具有争议。而DP1和DP2在糖尿病脑损伤中的作用仍不清楚。已有研究发现在抑制脑组织COX2能明显抑制自噬。这些结果提示糖尿病脑损伤的病生过程存在PGD2-DPs途径和自噬水平改变。本研究拟观察T2DM脑损伤大鼠脑组织PGD2-DPs途径和自噬水平的变化,并初步阐明糖尿病脑损伤机制可能涉及PGD2-DPs途径对自噬的调控。第一部分糖尿病脑损伤大鼠脑PGD2-DPs途径及自噬水平变化目的:观察糖尿病脑损伤大鼠皮层和海马PGD2-DPs途径及自噬水平变化;给予COX2抑制剂降低PGD2水平,观察其对糖尿病大鼠脑损伤的影响,拟初步观察PGD2-DPs途径及自噬水平变化与糖尿病脑损伤机制是否存在相关性。方法:1.从60只雄性SD大鼠(体质量为80-100g)中随机挑选10只作为正常对照组。剩余50只作为模型组,给予高脂高糖饮食喂养一个月后,腹腔注射STZ(40mg/kg)一次。造模完成后,将造模成功的大鼠随机分为3组:模型组,模型+COX2抑制剂低剂量组(Meloxicam,1mg·kg~(-1)),模型组+COX2抑制剂高剂量组(Meloxicam,3mg·kg~(-1))每组各10只。正常组和模型组灌胃给予0.5%CMC-Na,模型+COX2抑制剂组灌胃给与美洛昔康,继续正常饮食喂养八周。2.血糖仪检测大鼠空腹血糖;Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力;HE染色观察大鼠皮层和海马神经元;生化试剂盒检测大鼠血浆TG、TC和LDL的水平;ELISA试剂盒检测大鼠皮层和海马PGD2含量和大鼠血浆中胰岛素的含量;Western blotting测定大鼠皮层和海马COX2、DP1、DP2、P62和LC3BII蛋白的表达。结果:1.在停止给药时,模型组与COX2抑制剂组每组均剩9只大鼠。与正常对照组相比,模型组大鼠空腹血糖水平明显升高(P0.01),血浆胰岛素含量明显降低(P0.01);模型组大鼠血浆TC和TG水平明显升高(P0.01),而血浆LDL水平没有明显变化;模型组大鼠水迷宫行为学检测发现,寻台潜伏期时间明显延长(P0.01),平台穿梭次数明显减少(P0.01);糖尿病大鼠皮层和海马出现明显的神经元核固缩和核深染;模型组大鼠皮层和海马PGD2水平明显上升(P0.01);模型组大鼠海马及皮层COX2(P0.01)、DP2(P0.05)和p62(P0.01)蛋白表达明显升高,DP1(P0.01)和LC3BII(P0.01)的蛋白表达明显降低。2.与模型组相比,COX2抑制剂处理组大鼠血糖、血浆胰岛素、TG、TC和LDL水平没有明显变化;大鼠寻台潜伏期时间明显缩短(P0.01),平台穿梭次数明显增加(P0.01);大鼠皮层和海马的神经元核固缩和核深染得到明显改善;海马及皮层的PGD2含量明显降低(P0.01);大鼠海马及皮层中COX2(P0.01)和p62(P0.01)蛋白表达明显降低,而LC3BII的蛋白表达明显上升(P0.01)。结论:结果初步提示糖尿病脑损伤大鼠皮层和海马PGD2-DPs途径异常及自噬水平明显降低;抑制COX2降低PGD2含量,进而促进自噬可能对糖尿病大鼠脑损伤有保护作用。第二部分高糖处理HT22细胞PGD2-DPs途径及自噬水平变化目的:观察高糖处理HT22细胞PGD2-DPs途径及自噬水平变化;给予COX2抑制剂降低PGD2水平,在体外细胞水平初步观察PGD2-DPs途径及自噬水平变化与高糖致HT22细胞损伤机制的相关性。方法:1.高糖损伤HT22细胞模型建立及分组:高糖培养基(75mM)作用于HT22细胞36h,建立高糖致HT22细胞损伤模型。分为正常对照组、高糖处理组(HG)。HG+COX2抑制剂(meloxicam)组,HG+自噬抑制剂(wortmannin)和HG+自噬激动剂(rapamycin)组。2.主要观察指标:采用光镜观察各组HT22细胞数目和形态;ELISA测定细胞PGD2含量;透射电镜检测细胞自噬溶酶体数量;MTT法测定细胞的存活率;LDH测定细胞死亡率;流式细胞术检测细胞凋亡和坏死率。Western blotting测定细胞DP1、DP2、P62和LC3BII蛋白的表达。结果:1.与正常组相比,HG组HT22细胞的MTT值和细胞数目明显降低;LDH漏出率、凋亡和坏死率明显上升;自噬溶酶体数量明显上升;PGD2含量明显升高(P0.01);COX2(P0.01)、DP1(P0.01)、DP2(P0.05)和P62(P0.05)蛋白表达明显升高,而LC3BII(P0.01)蛋白表达明显降低。2.与HG组相比,自噬抑制剂能明显降低HG组HT22细胞的MTT值,而自噬激动剂能明显升高HG组HT22细胞的MTT值;COX2抑制剂能明显增加HG组HT22细胞的MTT值和细胞数目,降低LDH漏出率及凋亡和坏死率;COX2抑制剂能明显降低HG组HT22细胞的PGD2含量(P0.01);COX2抑制剂能明显降低HG组HT22细胞COX2(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表达,而明显升高LC3BII(P0.01)蛋白表达。结论:结果初步提示高糖处理HT22细胞PGD2-DPs途径异常及自噬水平明显降低;COX2抑制剂对高糖致HT22细胞有保护作用,其可能涉及降低PGD2含量,进而升高自噬水平。第三部分PGD2-DP2调控自噬对高糖致HT22细胞损伤的作用观察目的:观察DP2干预对高糖致HT22细胞损伤的影响,并初步明确其机制是否通过PI3K/AKT/mTOR通路进而影响自噬调控。方法:1.实验分组:高糖培养基(75mM)作用于HT22细胞36h,并分别给与DP2激动剂和抑制剂,以及DP2激动剂和抑制剂分别联合给予自噬促进剂和自噬抑制剂。实验分组为:正常组、HG组、HG+DP2激动剂组、HG+DP2激动剂+rapamycin组、HG+DP2抑制剂组和HG+DP2抑制剂+wortmannin组2.主要观察指标:采用光镜观察各组HT22细胞数目和形态;MTT检测细胞存活率;LDH检测细胞死亡率;流式细胞术检测细胞凋亡和坏死率;Western blotting测定细胞中PI3K、AKT、p-AKT(s473)、mTOR、p-mTOR(s2448)、p62和LC3BII蛋白的表达。结果:1.相比于HG组,HG+DP2激动剂组HT22细胞的MTT值明显降低(P0.05),而LDH漏出率明显升高(P0.01);HG+DP2抑制剂组HT22细胞的MTT值明显升高(P0.05),而LDH漏出率明显降低(P0.05)。相比于HG+DP2激动剂组,HG+DP2激动剂+rapamycin组HT22细胞的MTT值明显升高(P0.05),LDH漏出率明显降低(P0.01)。相比于HG+DP2抑制剂组,HG+DP2抑制剂+wortmannin组HT22细胞的MTT值明显降低(P0.05),LDH漏出率明显升高(P0.01)。2.光镜下可见,与正常组相比,HG组HT22细胞数目明显降低。与HG组相比,HG+DP2激动剂组HT22细胞的细胞数目明显降低,而HG+DP2抑制剂组HT22细胞的细胞数目明显升高。与HG+DP2激动剂组相比,HG+DP2激动剂+rapamycin组HT22细胞的细胞数目明显升高,与HG+DP2抑制剂组相比,HG+DP2抑制剂+wortmannin组HT22细胞的细胞数目明显降低。3.流式细胞术检测发现,与正常组相比,HG组HT22细胞的坏死和凋亡率明显增加;DP2激动剂能明显进一步升高HG处理HT22的细胞的坏死和凋亡率,而合用rapamycin能明显阻遏DP2激动剂的效应;DP2抑制剂能明显降低HG处理的HT22细胞坏死和凋亡率,而合用wortmannin能明显阻遏DP2抑制剂的效应。4.与正常组相比,HG组HT22细胞中PI3K(P0.05)、AKT(P0.01)、p-AKT(s473)(P0.01)、mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.01)的蛋白表达明显升高,而LC3BII(P0.05)的蛋白表达明显降低。与HG组相比,HG+DP2激动剂组HT22细胞中PI3K(P0.05)、AKT(P0.05)、p-AKT(s473)(P0.05)、mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.01)蛋白表达明显升高,而LC3BII(P0.05)蛋白表达明显降低;HG+DP2抑制剂组HT22细胞中PI3K(P0.05)、AKT(P0.05)、p-AKT(s473)(P0.05)、mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表达的明显降低,而LC3BII(P0.05)蛋白表达明显升高。与HG+DP2激动剂组相比,HG+DP2激动剂+rapamycin组HT22细胞中mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.01)和p62(P0.01)的蛋白表达明显降低,而LC3BII(P0.05)蛋白表达明显升高,PI3K、AKT和p-AKT(s473)蛋白表达没有明显影响。相比于HG+DP2抑制剂组,HG+DP2激动剂+wortmannin组HT22细胞中p62(P0.01)蛋白表达明显升高,LC3BII(P0.05)蛋白表达明显降低,而PI3K、AKT、p-AKT(s473)、mTOR和p-mTOR(s2448)蛋白表达没有明显影响。结论:DP2受体激动能激活PI3K/AKT/mTOR通路,进而抑制自噬,促进了高糖致HT22细胞损伤。第四部分PGD2-DP1调控自噬对高糖致HT22细胞损伤的作用观察目的:观察DP1干预对高糖致HT22细胞损伤的影响,并初步明确其机制是通否过PKA/mTOR通路进而调控自噬。方法:1.DP1干预对高糖致HT22细胞损伤、自噬水平和cAMP/PKA-C/mTOR通路的影响观察。(1)高糖培养基(75mM)作用于HT22细胞36h,高糖刺激的同时分别给与DP1的激动剂和抑制剂,给与DP1抑制剂的同时给与rapamycin。实验分组:正常组、HG组、HG+DP1激动剂组、HG+DP1抑制剂组和HG+DP1抑制剂+rapamycin组(仅用于MTT,LDH和流式细胞术实验)。(2)主要观察指标:MTT检测细胞存活率,LDH漏出率测定细胞死亡率;采用光镜观察细胞数目和形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡和坏死率;ELISA测定细胞cAMP含量;Western blotting测定细胞PKA-C(α/β)、mTOR、p-mTOR(s2448)、p62和LC3BII蛋白表达。2.DP1是否通过PKA-C调控mTOR表达观察(1)DP1通过PKA-C影响mTOR表达观察:实验分组:正常组、正常+空载病毒组、HG组、HG+空载病毒组、HG+PKA-C(α/β)shRNA(α和β分别沉默)组、HG+DP1激动剂、HG+PKA-C(α/β)shRNA(α和β分别沉默)+DP1激动剂组。采用Western blotting观察HT22细胞PKA-C(α/β)、mTOR和p-mTOR(s2448)蛋白表达。(2)PKA-C与mTOR相互作用观察:采用免疫共沉淀技术检测PKA-C(α/β)和mTOR是否具有直接结合。结果:1.DP1干预对高糖致HT22细胞损伤的自噬水平和cAMP/PKA-C/mTOR通路的影响。(1)与HG组相比,HG+DP1激动剂组HT22细胞的MTT值明显升高(P0.05),而LDH漏出率明显降低(P0.05);HG+DP1抑制剂组HT22的MTT值明显降低(P0.05),而LDH的漏出率明显升高(P0.05)。与HG+DP1抑制剂组相比,HG+DP1抑制剂合用rapamycin后能明显阻遏DP1抑制剂对HG处理HT22细胞MTT值和LDH的漏出率的影响。(2)光镜下可见,与HG组相比,HG+DP1激动剂组HT22细胞数目明显增加;HG+DP1抑制剂组HT22细胞数目明显降低。与HG+DP1抑制剂组相比,HG+DP1抑制剂合用rapamycin能明显升高HT22细胞的细胞数目。(3)与正常组相比,HG组HT22细胞cAMP含量明显升高(P0.05)。与HG组相比,HG+DP1激动剂组cAMP含量明显增加(P0.05),而HG+DP1抑制剂组cAMP含量明显降低(P0.01)。流式细胞术检测也发现,DP1激动剂能明显降低HG处理HT22细胞的坏死和凋亡率;DP1抑制剂能明显升高HG处理HT22细胞的坏死和凋亡率,而合用rapamycin能明显阻遏DP1抑制剂的效应。(4)与正常组相比,HG组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.05)、mTOR(P0.05),p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.01)蛋白表达明显上升,而LC3BII(P0.01)蛋白表达明显降低。与HG组相比,HG+DP1激动剂组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.05)和LC3BII(P0.05)蛋白表达明显上调,而mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表达明显降低;HG+DP1抑制剂组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.05)和LC3BII(P0.05)蛋白表达明显降低,而mTOR(P0.05),p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表达明显升高。2.DP1通过PKA-C影响mTOR表达(1)与正常组相比,HG组中HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.01)、mTOR(P0.01)和p-mTOR(s2448)(P0.01)蛋白表达明显升高。与HG组相比,HG+PKA-C(α)shRNA组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.01)蛋白表达明显降低,而mTOR(P0.01)和p-mTOR(s2448)(P0.01)蛋白表达明显上升;PKA-C(β)shRNA组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.01)蛋白表达明显降低,mTOR(P0.01)和p-mTOR(s2448)(P0.01)蛋白表达明显上升。(2)与HG组相比,HG+DP1激动剂组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.05)蛋白表达明显升高,mTOR(P0.05)和p-mTOR(s2448)(P0.05)蛋白表达明显降低。与HG+DP1激动剂组相比,HG+PKA-C(α)shRNA+DP1激动剂组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.05)蛋白表达明显降低,mTOR(P0.05)和p-mTOR(s2448)(P0.05)蛋白表达明显上升;HG+PKA-C(β)shRNA+DP1激动剂组HT22细胞中PKA-C(α/β)(P0.05)的蛋白表达明显降低,mTOR(P0.05)和p-mTOR(s2448)(P0.05)蛋白表达明显升高。(3)Co-IP实验证明PKA的催化亚基与mTOR有直接结合。结论:(1)mTOR可能是DP1下游通路蛋白;PKA的催化亚基与mTOR有直接结合。(2)PKA的催化亚基α和β都参与了mTOR表达的抑制。(3)DP1受体通过激活PKA/mTOR通路促进自噬改善高糖致HT22细胞损伤。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R747.9
【部分图文】：

体质量,糖尿病大鼠,血浆胰岛素,血糖

重庆医科大学博士研究生学位论文2 结果2.1 糖尿病大鼠体质量、血糖和血浆胰岛素的变化与正常组相比，模型组和给药组大鼠血糖含量明显升高(P<0.01)，胰岛素含量和体质量明显降低(P<0.01)。以上结果说明模型组和给药组大鼠基本符合 T2DM 特征。COX2 抑制剂组大鼠血糖、胰岛素和体质量均没有明显变化(图 1)。

糖尿病大鼠,低密度脂蛋白,总胆固醇,甘油三酯

图 1 糖尿病大鼠血糖、血浆胰岛素和体质量的变化(x± s ,n=9)1The levels of blood glucose, plasma insulin and body weight of the diabetic rats(x± s ,n=9).**P<0.01 compared with normal group.2 糖尿病大鼠血浆 TG、TC 和 LDL 水平变化与正常组相比，模型组和给药组大鼠血浆中 TG(P<0.01)和 TC(P<0.01)的含量显上升，而 LDL 没有没有明显变化。以上结果说明模型组和给药组大鼠基本符合 T2DM 特征。COX2 抑制剂组大鼠血浆 TG、TC 和 LDL 没有明显改变(图 2)

轨迹图,学习记忆功能,糖尿病大鼠,大鼠

重庆医科大学博士研究生学位论文2.3 糖尿病大鼠学习记忆能力改变与正常组相比，模型组大鼠寻台潜伏期在第 4 天开始出现明显延长 (P<0.05)；且第 5 天的穿越平台次数也明显减少(P<0.01)，说明大鼠的学习和记忆功能有降低。与模型组相比，COX2 抑制剂组大鼠的寻台潜伏期明显缩短(P<0.01)，且第 5天的穿越平台次数也明显增加(P<0.01)，说明大鼠的学习记忆功能得到明显改善(图 3-1)。从寻台的轨迹图上我们也可以看出，正常组大鼠的寻台的活动区域集中在平台位置附近，模型组大鼠寻台的活动区域明显偏离平台位置，在给与 COX2抑制剂后大鼠寻台活动区域逐渐向平台附近区域靠近(图 3-2)。

【参考文献】