GM1促进α-突触核蛋白自噬保护帕金森病的作用机制研究

发布时间：2020-09-29 11:55

　　研究目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征之一是多巴胺能神经元中路易小体的堆积。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在脑部以及脊髓表达较多,是路易小体的主要成分。异常的α-syn会影响递质的释放,酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表达与活性,造成神经元氧化应激等一系列毒性损伤。自噬是细胞清除异常细胞器、蛋白质等成分的正常生理过程,对中枢神经系统疾病有一定的保护作用。因此,通过增强自噬清除异常的α-syn是治疗帕金森病非常有潜力的方法。单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)在临床上可用于帕金森病的治疗,临床和动物实验都证明GM1能够缓解帕金森病的发病进程,但是GM1的具体作用机制并不明确,需要更多的研究阐明其机制。本课题组前期通过动物实验发现GM1能够改善MPTP模型小鼠行为学异常和多巴胺神经递质的减少,增加纹状体细胞自噬体的数量;细胞研究发现GM1可以促进α-syn的清除,其作用机制可能与自噬有关。本实验旨在前期研究的基础上,深入探究GM1促进自噬与α-syn清除之间的关系,并确定GM1在自噬通路上的靶标蛋白。研究方法首先,本研究在细胞水平研究GM1促进α-syn自噬性降解的作用机制。在PC12~(α-syn A53T)条件过表达细胞中,采用Western blot技术筛选GM1的最佳作用浓度与作用时间,使用CQ研究溶酶体功能在GM1促进α-syn降解中的影响。然后利用Western blot技术检测GM1对α-syn以及自噬相关蛋白ULK1,p-ULK1~(Ser555),p62,LC3表达的影响;利用3-MA和自噬激活剂rapamycin作比较,确定GM1促进自噬与α-syn清除之间的关系;使用免疫荧光技术和激光共聚焦成像系统考察GM1,LC3和α-syn共定位情况,进一步验证GM1促进α-syn自噬性降解。确认GM1促进α-syn自噬性降解作用基础上,进一步研究GM1在自噬信号通路中靶标蛋白。利用ACTP工具预测和分子对接,预测GM1潜在靶点。采用q-PCR技术检测在SH-SY5Y细胞给予GM1后,ATG13 mRNA的表达变化。使用免疫荧光技术和激光共聚焦成像系统考察GM1对ATG13表达的影响。通过免疫共沉淀和Western blot技术检测GM1对ATG13与ULK1的相互作用的影响,探究GM1是否通过激活ATG13促进ULK1复合体的形成。最后,使用免疫荧光技术和激光共聚焦成像系统进一步考察GM1与ATG13的共定位情况,进一步确定GM1对ATG13的靶向作用。研究结果:在PC12~(α-syn A53T)条件过表达细胞中使用多西环素(Doxycycline,Dox)诱导12小时,然后给予40μM GM1作用24小时能够明显降低α-syn的表达,增加TH的表达,促进LC3 I向LC3 II转化,所以选择40μM作用24小时的给药方式。CQ能够抑制GM1对α-syn的降解作用,说明GM1的作用与溶酶体功能相关。PC12~(α-syn A53T)条件过表达细胞经DOX诱导后,α-syn表达显著上调(P㩳0.01),给予GM1后能够显著改善此情况(P㩳0.01),但是给予3-MA可以显著逆转GM1的改善作用(P㩳0.01)。与DOX诱导组相比,GM1能够增加LC3 II和LC3 I的比率(P㩳0.01),减少自噬底物蛋白p62(p㩳0.01)表达,上调自噬启动关键蛋白ULK1(P㩳0.01)以及激活相关的p-ULK1~(Ser555)蛋白(P㩳0.01)的表达,经3-MA处理后能逆转上述蛋白表达情况。利用免疫荧光技术和激光共聚焦成像系统观察PC12~(α-syn A53T)条件过表达细胞经DOX诱导并给予GM1后,LC3与α-syn出现明显的共定位,表明GM1促进自噬体对α-syn的吞噬。GM1通过化学反应接上FITC荧光标记,采用激光共聚焦3D成像功能确定带有FITC荧光标记的GM1-FITC能够在细胞内特异性分布,可用于GM1在细胞内的示踪。采用免疫荧光技术,使用GM1-FITC进一步探究GM1和α-syn或LC3在细胞内的空间关系,激光共聚焦拍照发现GM1-FITC与α-syn或LC3皆存在明显的共定位。以上结果说明GM1对α-syn的清除作用与其促进自噬相关,GM1可能直接参与到自噬体对α-syn的吞噬过程中。计算机分子对接结果显示,ATG13可能是GM1作用于自噬信号通路的靶标蛋白。SH-SY5Y细胞给予GM1后,ATG13 mRNA的表达均有一定上升,但无显著差异(P㧐0.05)。免疫荧光结果显示,GM1增加ATG13的表达量与聚集量,表明GM1促进α-syn降解可能与其激活ATG13蛋白活性相关。通过免疫共沉淀和Western blot技术检测发现GM1上调ATG13蛋白的表达,并增加ATG13与ULK1的相互作用,说明GM1对ATG13的激活最终会促进ULK1复合体的形成。激光共聚焦检测发现GM1与ATG13有明显共定位,说明GM1与ATG13空间上存在相互作用。以上实验结果表明GM1能够通过上调ATG13表达,增加其与ULK1蛋白的结合,最终激活下游自噬通路。结论:Western blot和免疫荧光等实验结果表明,GM1能够增加异常α-syn的清除作用,促进其自噬性降解;免疫荧光和免疫共沉淀等实验结果显示GM1靶向作用ATG13,增强其与ULK1的结合。
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R742.5
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一章前言
    第一节帕金森病的背景
    第二节 Α-SYN与帕金森病
        2.1 α-syn的结构与生理功能
        2.2 异常α-syn与帕金森病
    第三节 Α-SYN与自噬
        3.1 自噬与帕金森病
        3.2 α-syn与自噬的联系
        3.3 自噬调节在帕金森病治疗中的前景
    第四节 GM1神经节苷脂
        4.1 GM1的结构及生理功能
        4.2 GM1在神经退行性疾病中的作用研究
    第五节立题依据和研究内容
第二章 GM1促进Α-SYN降解的作用机制研究
    第一节实验材料
        1.1 细胞株
        1.2 主要药品与试剂
        1.3 主要仪器
    第二节实验方法
α-synA53T条件过表达细胞复苏、传代及冻存'>        2.1 PC12^α-synA53T条件过表达细胞复苏、传代及冻存
        2.2 细胞给药方式
α-synA53T条件过表达细胞的作用浓度与时间'>        2.3 Westernblot筛选GM1在PC12^α-synA53T条件过表达细胞的作用浓度与时间
        2.4 Westernblot测定溶酶体在GM1促进α-syn降解中的作用
        2.5 Westernblot测定GM1对α-syn蛋白表达水平的影响
        2.6 westernblot测定GM1对自噬信号通路相关蛋白表达水平的影响
α-synA53T条件过表达细胞内α-syn与LC3共定位的影响'>        2.7 激光共聚焦成像检测GM1对PC12^α-synA53T条件过表达细胞内α-syn与LC3共定位的影响
        2.8 GM1-FITC的合成步骤
α-synA53T条件过表达细胞内的分布情况'>        2.9 激光共聚焦3D成像观察GM1-FITC在PC12^α-synA53T条件过表达细胞内的分布情况
α-synA53T条件过表达细胞GM1-FITC与α-syn共定位情况'>        2.10 激光共聚焦成像检测PC12^α-synA53T条件过表达细胞GM1-FITC与α-syn共定位情况
α-synA53T条件过表达细胞GM1-FITC与LC3共定位情况'>        2.11 激光共聚焦成像检测PC12^α-synA53T条件过表达细胞GM1-FITC与LC3共定位情况
        2.12 统计学处理
    第三节实验结果
        3.1 GM1作用浓度筛选
        3.2 GM1作用时间筛选
        3.3 溶酶体功能在GM1促进α-syn降解中影响
α-synA53T条件过表达细胞中α-syn和TH表达的影响'>        3.4 GM1对PC12^α-synA53T条件过表达细胞中α-syn和TH表达的影响
α-synA53T条件过表达细胞中自噬相关蛋白表达的影响'>        3.5 GM1对PC12^α-synA53T条件过表达细胞中自噬相关蛋白表达的影响
α-synA53T条件过表达细胞内α-syn与LC3共定位的影响'>        3.6 GM1对PC12^α-synA53T条件过表达细胞内α-syn与LC3共定位的影响
α-synA53T条件过表达细胞内的三维分布'>        3.7 GM1-FITC在PC12^α-synA53T条件过表达细胞内的三维分布
α-synA53T条件过表达细胞内GM1-FITC与α-syn的共定位'>        3.8 PC12^α-synA53T条件过表达细胞内GM1-FITC与α-syn的共定位
α-synA53T条件过表达细胞内GM1-FITC与LC3的共定位'>        3.9 PC12^α-synA53T条件过表达细胞内GM1-FITC与LC3的共定位
    第四节小结与讨论
第三章 GM1在自噬信号通路中靶标蛋白的研究
    第一节实验材料
        1.1 细胞株
        1.2 主要药品与试剂配置
        1.3 主要仪器
    第二节实验方法
        2.1 SH-SY5Y细胞复苏、传代及冻存
        2.2 GM1靶标蛋白的预测及分子对接
        2.3 Q-PCR测定GM1对ATG13mRNA表达水平的影响
        2.4 激光共聚焦成像检测GM1对SH-SY5Y细胞内ATG13的影响
        2.5 免疫共沉淀测定GM1对SH-SY5Y细胞内ATG13与ULK1相互作用的影响
        2.6 激光共聚焦成像检测SH-SY5Y细胞内GM1-FITC与ATG13共定位情况
        2.7 统计学处理
    第三节实验结果
        3.1 GM1作用自噬信号通路的靶标蛋白预测
        3.2 GM1对SH-SY5Y细胞中ATG13mRNA表达的影响
        3.3 GM1对SH-SY5Y细胞内ATG13的影响
        3.4 GM1增加SH-SY5Y细胞内ATG13与ULK1相互作用
+诱导的PD细胞模型中GM1-FITC与ATG13的共定位'>        3.5 MPP⁺诱导的PD细胞模型中GM1-FITC与ATG13的共定位
    第四节小结与讨论
第四章总结与展望
参考文献
硕士期间论文成果
致谢

【参考文献】