NKCC1对胶质母细胞瘤上皮间质转化作用的研究

发布时间：2020-09-29 19:35

　　 胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤。作为肿瘤细胞的体积调节蛋白,NKCC1(Sodium-potassium-chloride cotransporter 1钠钾氯共转运体1)的表达量随胶质瘤的恶性程度逐级递增,并且NKCC1被提示与胶质母细胞瘤的侵袭程度相关。然而,关于NKCC1在胶质瘤中上皮间质样转化过程(epithelial to mesenchymal-like transition process)的研究鲜有报道。前期研究中我们观察到改变NKCC1蛋白量的表达可以导致胶质瘤细胞的形态、极性及细胞间黏附发生改变。文中,我们研究了NKCC1是否可以促进胶质瘤上皮间质转化样过程。布美他嗪特异性药物抑制NKCC1以及敲低NKCC1表达均可有效降低间质型标记的表达,如N-cadherin,vimentin和snail,而增加了上皮型标记物的表达,如E-cadherin,提示NKCC1可以促进胶质瘤中的上皮间质转化过程。本研究提示NKCC1的活性增高在胶质瘤的上皮间质转化过程中扮演了重要的角色,这或许为抑制恶性颅内肿瘤的迁移播散提供了新的治疗策略。本课题研究不同侵袭播散程度胶质瘤组织中NKCC1的表达,并在体外实验研究NKCC1在胶质瘤中上皮间质转化过程中的作用及其可能机制。课题研究分为以下四个部分:1、NKCC1在不同组织级别胶质瘤中的表达情况。应用免疫组织化学染色法对我院手术采集的52例不同病理级别的胶质瘤组织样本制作而成的组织芯片进行检测,分析样本中NKCC1表达情况的差异。采用western blot的方法筛选出表达NKCC1蛋白较高的恶性胶质瘤细胞系进行后续体外实验。结果显示,本院采集的胶质瘤活体组织样本中,NKCC1在伴有明显颅内播散及多灶性特征的胶质母细胞瘤组织样本中高度表达,影像学显示肿瘤范围相对局限的胶质母细胞瘤患者组织样本中则相对低表达;且在胶质母细胞瘤组织样本较较低级别胶质瘤样本中表达增高。2、NKCC1在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用。使用western blot检测显示U87和SNB19两个胶质瘤细胞系中NKCC1蛋白表达量较高,用于后续体外实验研究。应用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞,在U87和SNB19两种细胞系中,应用干扰NKCC1表达的shRNA对细胞进行病毒转染,分为shNKCC1-1组、shNKCC1-2组和scrambled组(转入无义序列);另外使用特异性抑制剂布美他嗪抑制NKCC1活性,分为control组、BMT(10μΜ)组、BMT(100μΜ)组)。western blot检测不同的处理组中NKCC1蛋白表达量,Transwel实验和划痕实验分别检测胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。结果显示,应用shRNA敲低NKCC1组以及药物抑制NKCC1组胶质瘤细胞的侵袭迁移能力均受到抑制。3、NKCC1对胶质瘤细胞系上皮间质转化功能的影响。应用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞,在U87和SNB19两种细胞系中,应用干扰NKCC1表达的shRNA对细胞进行转染以及特异性药物抑制NKCC1的方法,在不同的处理组中,western blot及细胞免疫荧光方法分别检测EMT相关蛋白表达。结果显示:药物处理组以及NKCC1敲低组间质型相关蛋白发生表达下调,上皮型蛋白上调,表明NKCC1可以促进胶质瘤细胞系EMT转化。4、NKCC1通过激活Rac1和RhoA信号通路诱导胶质瘤上皮间质转化。TCGA数据库数据分析显示SLC12A2基因的表达量与RAC1和RHOA基因的表达量呈正相关。通过GST-TRBD与GST-PBD下拉实验,在U87-MG和SNB19胶质瘤细胞系中,布美他嗪药物抑制组较药物溶媒组RhoA和Rac1活性水平降低。在U87-MG和SNB19胶质瘤细胞系中,NKCC1敲低组的细胞较空载对照组的RhoA和Rac1活性水平更低。最后,通过Transwell小室实验证实,Rac1或者RhoA小分子抑制剂(Y27632、NSC23766)联合NKCC1抑制(布美他嗪药物抑制或者NKCC1基因敲低)与NKCC1单独抑制对胶质瘤细胞的迁移能力影响无统计学差异。这证实了在NKCC1调控胶质瘤细胞上皮间质转化的过程中,需要RhoA和Rac1的激活,且该信号通路单向有效。结论:1、发生颅内播散的胶质母细胞瘤样本中NKCC1表达量显著高于未发现明显颅内播散样本;胶质母细胞瘤组织样本中NKCC1表达明显高于较低级别胶质瘤组织样本。2、抑制NKCC1蛋白的表达及活性功能,均可有效抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移能力。3、NKCC1可以促进U-87和SNB19细胞系上皮间质转化,减少细胞间黏附,从而促进肿瘤细胞的适形播散。4、NKCC1作为上游调控蛋白,通过激活Rac1和RhoA信号通路,对胶质瘤上皮间质转化过程进行诱导。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

免疫组织化学法检测NKCC1在不同组织学级别胶质瘤样本中的表达情况：(a)截取8位伴有明显颅内播散、具有多发肿瘤灶的胶质母细胞瘤患者的MRI影像片；(b)组织芯片分析高侵袭性胶质母细胞瘤样本瘤中心与瘤周NKCC1表达量；(c)免疫组化检测高侵袭组胶质母细胞瘤样本与较低侵袭组胶

Westernblot检测NKCC1蛋白的表达量筛选出高表达细胞系（β-tublin作为阳性对照）

Westernblot检测shRNA敲低NKCC1后NKCC1蛋白的表达（β-actin作为阳性对照）

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本文编号：2830166