核因子Nrf2调控的多种代谢在胶质母细胞瘤增殖和药物耐受中作用及机制的研究

发布时间：2020-10-21 18:57

　　 胶质母细胞瘤是侵润性强、恶性度高的致死性成人中枢神经系统肿瘤。对放疗和化疗均耐受。因侵润性较强,手术不能达到全切。尽管胶质母细胞瘤的诊疗和基础研究已经取得显著进展,但临床患者预后仍极不理想,胶质母细胞瘤的靶向治疗急待进一步发掘。核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子。主要通过与抗氧化顺式作用元件结合以调控ARE控制基因的表达。ARE控制基因包括抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因、多种转运蛋白。除了介导抗氧化酶基因和解毒基因的表达,Nrf2还可广泛地调控细胞的多种代谢,如抑制脂肪合成,促进脂肪酸β氧化,促进磷酸戊糖代谢,增加GSH生成、NADPH再生和嘌呤生物合成。Nrf2和Nrf2调控的下游基因对减轻或消除毒物、致癌物的毒性作用至关重要,给予天然或人工合成化合物激活Nrf2通路,可发挥解除毒物、致癌物毒性的作用。然而,最近不断增加的研究表明核因子Nrf2在肿瘤发生、发展的病理生理过程中具有"黑暗"的一面:Nrf2和其调控的下游基因在许多肿瘤细胞或组织中高表达,并且促进肿瘤细胞生存和增殖。此外,Nrf2可增强肿瘤对化疗药物的耐受性,是肿瘤耐药的重要原因。我们将研究核因子Nrf2在胶质母细胞瘤增殖和耐药中所发挥的作用,并从细胞代谢角度阐明Nrf2发挥促癌作用的机制。本课题共分成以下四个研究部分:第一部分核因子Nrf2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达模式及其对细胞增殖的影响目的:研究核因子Nrf2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达模式及评估其对细胞增殖的影响。方法:蛋白免疫印迹电泳和实时定量聚合酶链式反应评估核因子Nrf2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达模式;慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。细胞的增殖由CCK-8法评估。结果:和正常人脑星形细胞比较,四种胶质母细胞瘤细胞系(U251、U87、A172和SHG44)中Nrf2均高表达,其中U251细胞系的Nrf2表达水平最高,增殖速度也最快。通过慢病毒介导的shRNA感染细胞可成功建立Nrf2稳定下调的细胞系U251。核因子Nrf2下调后,胶质母细胞瘤细胞生长曲线变平缓,平板克隆实验形成的克隆直径变小,克隆形成减少。结论:和正常人脑星形细胞(NHA)比较,胶质母细胞瘤细胞系中的Nrf2均高表达,其中U251细胞系Nrf2的表达水平最高。细胞内核因子Nrf2的表达水平和细胞增殖速度呈正相关。慢病毒介导的shRNA感染细胞可成功建立Nrf2稳定下调的细胞系。核因子Nrf2下调后胶质母细胞瘤细胞增殖明显受到抑制。第二部分核因子Nrf2调控的能量代谢在胶质母细胞瘤细胞系增殖中的作用目的:研究Nrf2调控的能量代谢和能量代谢敏感AMPK-mTOR信号通路在胶质母细胞瘤增殖中的作用。方法:慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。细胞内ATP水平通过萤火虫荧光素酶为基础的荧光分光光度法检测。细胞内AMP/ATP比值由高效液相色谱法检测。细胞的增殖由CCK-8法评估。细胞内AMPK-mTOR通路状态由蛋白免疫印迹电泳评估。结果:核因子Nrf2下调后,细胞内ATP水平明显下降,AMP/ATP比值相应显著升高。并且核因子Nrf2下调后,细胞内能量代谢敏感AMPK通路也激活。给予AMPK特异性激动剂苯乙基双胍可模拟核因子Nrf2下调诱导的细胞增殖抑制和能量代谢障碍。结论:核因子Nrf2下调诱导的增殖抑制由能量代谢障碍和能量代谢敏感的AMPK通路激活所介导。第三部分核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤增殖中的作用目的:研究核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤增殖中的作用及机制。方法:慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。细胞内ROS水平由荧光分光光度法检测。细胞内GSH水平由分光光度法检测。细胞的增殖由CCK-8法评估。细胞内AKT、ERK1/2和STAT3活化状态由蛋白免疫印迹电泳评估。结果:核因子Nrf2下调后,细胞内GSH水平明显下降,ROS水平相应显著升高。并且核因子Nrf2下调后,胶质母细胞瘤细胞生长曲线变平缓,平板克隆实验形成的克隆直径变小,克隆形成减少。核因子Nrf2下调后,细胞内AKT、ERK1/2活化水平受抑制(STAT3活化状态变化不明显)。外源性给予NAC可清除细胞内升高的ROS,但不能恢复细胞内下降的GSH,也不能逆转Nrf2下调诱导的增殖抑制,而外源性给予GSH可清除细胞内升高的ROS,能恢复细胞内下降的GSH,还可显著逆转Nrf2下调诱导的增殖抑制。最后,给予AKT抑制剂(AKT inhibitor Ⅳ)、ERK1/2 抑制剂(U0126)和 STAT3 抑制剂(AG490),只有AKT抑制剂AKT inhibitor Ⅳ可对抗GSH的逆转作用。结论:细胞内GSH水平下降和AKT通路抑制在核因子Nrf2下调诱导的胶质母细胞瘤增殖抑制中发挥重要作用。第四部分核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤TMZ耐药中的作用目的:研究核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤TMZ耐药中的作用。方法:采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质母细胞瘤耐药细胞株U251TR和U87TR。CCK-8法评估耐药细胞的IC50和耐药指数。分光光度法检测细胞内GSH水平。蛋白免疫印迹电泳检测细胞内核因子Nrf2及GSH净生成相关的多种酶(GCLC、GS和GR)的表达水平。慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。CCK-8法评估替莫唑胺对耐药细胞U251TR和U87TR的毒性和增殖抑制作用。结果:通过体外分步诱导法成功建立了对替莫唑胺具有稳定耐药性的U251TR和U87TR细胞株。CCK-8法检测显示U251TR的耐药指数为10.92,U87TR的耐药指数为10.35。耐药细胞内GSH明显升高:U251TR较U251升高约3.7倍,U87TR较U87升高约2.4倍。蛋白免疫印迹电泳表明:在耐药细胞内核因子Nrf2及GSH净生成相关酶(GCLC、GS和GR)表达上调,而慢病毒介导的短发夹RNA下调TMZ耐药细胞内Nrf2后,TMZ耐药细胞系细胞内GSH水平明显下降,U251TR和U87TR细胞内GSH净生成相关酶(GCLC、GS和GR)表达亦降低。最后,CCK-8法检测表明:细胞内Nrf2下调后,可逆转耐药细胞对替莫唑胺的耐药性,而外源性补充GSH可削弱替莫唑胺对耐药细胞的毒性作用。结论:间歇TMZ浓度递增法成功建立人胶质母细胞瘤耐药性细胞株U251TR和U87TR。Nrf2依赖的GSH净生成与TMZ耐药性形成相关。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

??ＡＲＥ而激活该通路，见图３。??曼＾?誠曲舞器??Ｓ?兰?ｓｔａｔｅ?ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ??’［Ｋ而－；早吗；■■■１＾?Ｖ？＾??—＾?ＤＬＧ?ＥＴＧＥ?＾ＴＶ??Ｉ?驾子??ｕｎｄｅｒ?■?－＾＊－??ｉｎｄｕｃｅｄ?■??ｓｔａｔｅ?■??／＾Ｖ?＾??，?ＡＲＥ－ｄｒｉｖ＾ｎ?Ｏ＾ｎｅｔ??／?Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ??／?Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ??（?＾＾＾９?Ｃｈａｐｅｒｏｎ？??Ｖ?＾?ｓＭｉｆＪＳ｜Ｈ＾?Ｉ?Ｐｒｏｔｅａｆｔｏｍｅ??＼?＼?＇ｉｉｉｆｆｌｉｇ＾ａ—Ｌ?Ｖ＿＾?Ｊ?ｙ??Ｎｕｄｅｕｓ?／??閱２：?Ｋｅａｐｌ对核因子Ｎｒｆ２的调控（该图来源于Ｌｅｅ?ＤＨ，Ｇｏｌｄ艮，Ｌｉｎｋｅｒ?ＲＡ．?２０１２．??Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ?ｏｆ?ｏｘｉｄａｔｉｖｅ?ｄａｍａｇｅ?ｍｕｌｔｉｐｌｅ?ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ?ａｎｄ?ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ??ｄｉｓｅａｓｅｓ：化ｅｒａｐｅｕｔｉｃ?ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ?ｖｉａ?ｆｌｉｍａｒｉｃ?ａｄｄ?ｅｓ化ｒｓ．?Ｉｎｔ?Ｊ?Ｍｏｌ?Ｓｃｉ．?１３（９）：??１１７８３－８０３．）。??＾?ＪＮＫ?ＥＲＫ?ｐ３８?ｆ??／?％?１１?＾?ｉｔ??咬＞?，－ＳＥ＝?＝＝ｅｉＦ??＼?－一??Ｘ?ｃｏｒｅｇｕｌａｌｏｒｓ＾Ｍ?ＮＱＯＩ??鸿＾扉！＾广；＾??＝ｊｃＣＡＡ下?／?ＸＲＥ?ＡＲＥ?ｐ?￣??图３：信号通路对核因子Ｎ瓜的调控（该图來源于Ｌｅｅ?ＪＳ

ｓｕｐｅｒｏｘｅｓｍ山ａｓｅ，，ｇｕｔａｔｏｎｅ?ｐｅｒｏ谷脫甘狀还原酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，?ＧＲ）等，这些抗氧化酶具有清保护细胞免受氧自由基攻击。第二类是非酶类抗氧化系统，如ＧＳ、微量元素砸等（其中，在中枢神经系统，ＧＳＨ是脑内最有效的。而核因子Ｎｒ亿既可调控抗氧化酶系统，亦可调控非酶类抗氧化系ＲＥ通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。??核因子Ｎｒｆ２调控多种抗氧化酶??ｒｆ２可调控多种抗氧化酶（见圏４），如过氧化氨酶（ｃａｔａｌａｓｅ，?ＣＡＴ），化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ?ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，?ＳＯＤ），谷腕甘狀过氧化物酶（ｇｌｕｔｉｄａｓｅ，?ＧＰｘ），谷脫甘狀还原酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，?ＧＲ）及胞质硫氧ｏｓｏｌｉｃ?化ｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，ＴＸＮ）?１，和硫氧还蛋白还原酶（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ?ｒｅＤ）?１等。这些多种抗氧化酶均可清除细胞内氧自由基或还原己经的琉基。??＇＂－—

酸、半腊氨酸和甘氨酸）合成ＧＳＨ需经两步反应，分别由ｙ－谷氨醜半脱氨酸??合成酶（丫－ＧＵ）和谷脱甘化合成酶（ＧＳＨＳ）催化。谷腕甘化再生（ＧＳＳＧ一ＧＳＨ）??由谷腕甘化还原酶（ＧＲ）催化（详见图５）。??ＧＳＳＧ???牛??Ｆ巧ｅ?巧ｄｉｃａｌｓ??？?＼（ｇｒｊ??ＧＳＨ?ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ?＾??ＧＳＨ＜???Ａ??Ｇｌｙｃｉｎｅ?？?——??Ｇｌｕ－Ｃｙｓ??个??Ｃｙｓｔｅｉｎｅ?—?—ＨＣ？）??Ｇｌｕｔａｍａｔｅ??图５；从前体氨基酸合成谷脫甘化及谷耽甘狀再生，其中楠圆形标记的酶为核因??子Ｎｒｆ２调控範基因。??２．２?Ｎｒ口调控还原型辅酶ＩＩ?（ＮＡＤＰＨ）的合成和利用??Ｎｒｆ２调控的多种药物代谢酶和抗氧化酶（如ＡＫＲ、ＮＱ０１、ＧＳＲ１、ＴＸＮＲＤ１??等），在发挥功能时需辅助因子还原型烟醜胺腺嘿咚二核昔酸碟酸（即还原型辅??酶ＩＩ，或ＮＡＤＰＨ）作为供氨体ｆｓ—Ｗ。??－１５－??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 马利;王娟娟;高学军;王丽君;;老年缺血性卒中后继发性癫痫与Nrf2基因多态性的关联性研究[J];临床急诊杂志;2017年08期

2 段家翔;甯交琳;鲁开智;;Nrf2出核转运机制及意义的研究进展[J];医学研究生学报;2014年08期

3 吴畏;章海均;顾志谦;罗浩;;紫檀芪通过促进Nrf2核转移在调节髓核细胞炎症反应中的作用[J];中国细胞生物学学报;2016年10期

4 张美金;王莎莎;张钊;陈乃宏;胡金凤;;核转录因子Nrf2在帕金森病中的作用[J];神经药理学报;2016年01期

5 代歆悦;莫子茵;江娜;高爱莉;朱慧兰;;Nrf2信号通路在复发性外阴阴道念珠菌病发病机制中的作用[J];中国真菌学杂志;2017年04期

6 贠可力;于晓瑾;王振宇;;植物化学物质通过Nrf2及其相关蛋白防护/修复氧化应激损伤研究进展[J];天然产物研究与开发;2016年06期

7 马仁强;张明鑫;王健生;蔡惠;叶尔买克;段小艺;;Nrf2在不同肝癌细胞株中的表达及定位[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年06期

8 杨海明;张明鑫;王健生;蔡惠;马仁强;段小艺;;原发性胆囊癌中Nrf2的表达及意义[J];现代肿瘤医学;2010年04期

9 杨晓鹏;李秀娟;梁金宇;林勇平;张大鹏;张志敏;;全真一气汤对COPD模型小鼠Nrf2通路及对炎性细胞因子和肺组织超微结构的影响[J];中国实验方剂学杂志;2016年22期

10 耿倩雯;张继航;覃军;黄岚;晋军;;Nrf2基因单核苷酸多态性与急性高原病相关性研究[J];军事医学;2015年02期

相关博士学位论文 前10条

1 贾玥;核因子Nrf2调控的多种代谢在胶质母细胞瘤增殖和药物耐受中作用及机制的研究[D];南京大学;2016年

2 闫冰迪;Nrf2活化在萝卜硫素减轻博莱霉素所致肺纤维化中的作用[D];吉林大学;2017年

3 纪祥军;Nrf2在人胶质母细胞瘤血管生成中的作用研究[D];南京大学;2013年

4 黄宇晶;Nrf2对脑微血管内皮细胞血管新生的影响及机制研究[D];吉林大学;2017年

5 王慧;抗糖尿病药物中激活Nrf2通路的抗氧化剂对肿瘤转移的影响及机制研究[D];第三军医大学;2016年

6 刘瑜;根皮素上调Nrf2途径对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的神经保护及机制研究[D];山东大学;2016年

7 罗琳;丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶对Nrf2通路的影响及机制研究[D];浙江大学;2015年

8 张晓梅;Nrf2在病毒性心肌炎小鼠中的作用及葛根素干预的研究[D];吉林大学;2013年

9 况立洪;转录因子Nrf2对大鼠心肌微血管内皮细胞在血管生成中作用的影响及其机制的体外研究[D];第三军医大学;2013年

10 刁孟元;基于Akt/GSK-3β/Nrf2通路探讨低温对心肺复苏后脑损伤的保护作用[D];第二军医大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 展平;姜黄素激活Nrf2系统缓解线粒体损伤和胰岛素抵抗作用机制研究[D];福建中医药大学;2017年

2 李翔;槲皮素通过Nrf2通路对创伤性脑损伤后线粒体损伤的保护作用研究[D];南京大学;2017年

3 耿倩雯;Nrf2基因单核苷酸多态性和氧化应激与急性高原病的相关性研究[D];第三军医大学;2015年

4 钟炜轲;氟对小鼠成釉细胞Nrf2信号通路的作用研究[D];广东药学院;2012年

5 李娅楠;大米蛋白调控Nrf2通路及抗氧化机制研究[D];哈尔滨工业大学;2012年

6 李奉喜;应用基因芯片技术探索Nrf2介导的乳腺癌阿霉素耐药机制初步研究[D];广西医科大学;2017年

7 赵家玲;木犀草素激活Nrf2途径对高糖环境下肾脏系膜细胞的保护作用[D];南京中医药大学;2014年

8 马青;Nrf2在终末期肾脏病血管钙化中的作用研究[D];遵义医学院;2012年

9 海燕;非小细胞肺癌细胞中Nrf2的调控与生物学功能研究[D];浙江大学;2011年

10 王卓;Nrf2抑制剂对细粒棘球蚴原头节的作用[D];石河子大学;2015年

本文编号：2850477