帕金森病(Parkinson's disease,PD)作为全球第二大神经退行性疾病,影响着无数患者的身心健康。PD包含三大主要病理特征:中脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺能神经元进行性丢失、路易小体(Lewy body,LB)沉积以及慢性神经炎症。相应的,患者主要出现以下临床症状:运动障碍、肌肉强直、静止性震颤等运动症状,并伴有嗅觉减退、睡眠障碍、精神症状、认知障碍等非运动症状。大量研究表明PD是由多种遗传因素和环境因素共同引起的,其确切的发病机制尚不清楚,因此PD仍然是一种不能治愈的疾病。临床治疗上主要用左旋多巴(Levodopa,L-Dopa)弥补缺失的多巴胺(Dopamine,DA),从而缓解PD的运动症状,但这种疗法治标不治本,无法治愈PD或延缓疾病的进一步发展,且长期服用还会引发一系列的并发症,如运动障碍(L-Dopa-induced dyskinesias,LIDs)、症状波动等。因此,亟需深入探究PD的致病机制,为开发治疗PD的新型疗法提供方向。慢性神经炎症是PD的病理特征之一,在PD的发生发展中具有十分重要的作用。神经炎症与多巴胺能神经元退变密切关联,在炎症条件下,活化的胶质细胞释放促炎因子和神经毒性因子,如细胞因子、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和补体蛋白等,这会导致神经元损伤和变性。随着疾病进展,退变的神经元会释放腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)、α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)进一步激活胶质细胞,形成恶性的慢性炎症状态。并且多巴胺能神经元对胶质细胞引发的神经毒性更为敏感,导致SNc区胶质细胞活化增殖。小胶质细胞作为脑内固有免疫细胞,在神经炎症中扮演重要角色。活化的小胶质细胞主要表现为两种表型:M1型促炎表型和M2型抗炎表型。M1型小胶质细胞产生促炎因子、趋化因子、ROS和一氧化氮(Nitric oxide,NO),对神经元产生毒性损伤作用。M2型小胶质细胞会产生抗炎因子、神经营养因子,促进神经元存活和组织修复。研究发现PD进程中存在M1/M2型小胶质细胞表型转化,表现为M2型小胶质细胞减少,而M1型小胶质细胞增多。因此深入研究M1/M2型小胶质细胞表型转化机制,促进小胶质细胞由M1型向M2型转化,是阻止PD发展的新策略。β-抑制性蛋白(β-Arrestins,ARRBs)最初因能够介导G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)脱敏而被发现并命名,随后人们发现ARRBs还介导了受体的内化、泛素化和降解,并且可以作为支架蛋白与胞内多个分子发生结合,触发ARRB依赖性的信号通路,在炎症反应和炎性疾病中发挥重要作用。本实验前期发现ARRB2能够与NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein-3,NLRP3)结合并抑制NLRP3小体组装、活化,这是多巴胺D2受体(Dopamine D2 receptor,DRD2)和β2肾上腺素受体(β2-Adrenoreceptor,β2AR)发挥抗炎作用的关键机制。同时文献报道ARRB2参与LIDs的发生,敲除ARRB2加重LIDs,过表达ARRB2减轻LIDs。这些结果提示研究ARRBs可能参与PD的病理机制,然而ARRBs与PD发生的相关性尚未报道。在上述研究的基础上,本文第一部分运用Arrb1~(-/-)和Arrb2~(-/-)小鼠制备1-甲基,4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)PD模型,在整体水平探究ARRBs与PD的相关性。结果显示,ARRB1敲除减轻PD小鼠中脑SNc区多巴胺能神经元丢失和胶质细胞增殖活化,同时抑制PD小鼠中脑组织中M1型标志物的表达,并促进M2型标志物的表达;而ARRB2敲除加重PD小鼠中脑SNc区多巴胺能神经元丢失和胶质细胞增殖活化,同时升高PD小鼠中脑组织中M1型标志物的表达,而降低M2型标志物的表达。在此基础上,本文第二部分工作进一步在离体水平上研究ARRBs对小胶质细胞极化的调节作用以及对中脑神经元存活的影响。结果显示,ARRB1促进M1型并抑制M2型小胶质细胞极化,干扰ARRB1减轻M1型小胶质细胞条件培养基(Conditioned medium,CM)引起的多巴胺能神经元损伤;ARRB2抑制M1型并促进M2型小胶质细胞极化,敲除ARRB2加重M1型小胶质细胞CM引起的多巴胺能神经元损伤。基于此,本文第三部分阐明ARRBs调节小胶质细胞表型转化的分子机制。结果显示,干扰ARRB1抑制NF-κB、STAT1信号通路并促进STAT6通路的活化,干扰ARRB2促进NF-κB、STAT1信号通路并抑制STAT6通路的活化。继而我们运用转录组学测序试图寻找ARRB1和ARRB2在调节小胶质细胞极化中发挥相反作用的关键节点分子,结果显示,Nprl3是ARRB1和ARRB2在M1型小胶质细胞表型转化中发挥相反作用的关键分子,Samd4是ARRB1和ARRB2在M2型小胶质细胞表型转化中发挥相反作用的关键分子。综上所述ARRB1和ARRB2在PD的病理过程中起着重要但相反的作用,ARRBs通过Nprl3和Samd4调节小胶质细胞M1/M2表型的转化,从而影响多巴胺能神经元的存活,进而参与PD的病理过程。第一部分β-Arrestin1/2与帕金森病发生的相关性研究目的:研究ARRBs在PD发生中的作用。方法:采用WT小鼠制备MPTP急性模型,运用Western Blot检测小鼠中脑组织中ARRB1和ARRB2蛋白表达水平,运用免疫荧光检测SNc区ARRB1和ARRB2表达及与离子钙接头蛋白-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)阳性小胶质细胞共定位情况。采用WT、Arrb1~(-/-)和Arrb2~(-/-)小鼠制备MPTP急性模型,运用酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、胶质源性纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)和Iba-1免疫组织化学染色观察中脑脑片多巴胺能神经元丢失、星形胶质细胞和小胶质细胞活化情况;提取中脑组织RNA,运用RT-PCR检测M1/M2型小胶质细胞表型标志物的mRNA水平;提取中脑组织蛋白,运用Western Blot检测M1/M2型小胶质细胞表型标志物的蛋白水平。结果:1)MPTP急性模型小鼠中脑组织中ARRB1表达上调,ARRB2表达下调,且在Iba-1~+小胶质细胞上表现出相同的趋势;2)敲除ARRB1减轻MPTP急性模型小鼠中脑SNc区多巴胺能神经元丢失和胶质细胞活化,同时减少中脑组织中M1型标志物的表达,并促进M2型标志物的表达;3)敲除ARRB2加重MPTP急性模型小鼠中脑SNc区多巴胺能神经元丢失和胶质细胞活化,同时增加中脑组织中M1型标志物而减少M2型标志物的表达。结论:ARRBs可能通过调节小胶质细胞极化参与PD的病理过程,并且ARRB1和ARRB2的作用相反。第二部分β-Arrestin1/2对小胶质细胞极化的调节及其对神经元的影响目的:研究ARRBs对小胶质细胞M1/M2表型的调节作用及对神经元存活的影响。方法:培养WT新生小鼠原代小胶质细胞,给予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,100 ng/ml)和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ,20 ng/ml)或白介素-4(Interleukin-4,IL-4,20 ng/ml)刺激,24 h后应用Western Blot检测ARRBs表达水平。转染siRNA干扰原代小胶质细胞中ARRB1的表达,48 h后运用Western Blot检测干扰效率。转染ARRB1 siRNA的小胶质细胞给予LPS+IFN-γ或IL-4刺激,6 h后应用RT-PCR检测M1型标志物(IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS)或M2型标志物(Arg1、Ym1、CD206)mRNA水平,观察干扰ARRB1对小胶质细胞表型转化的影响。培养WT和Arrb2~(-/-)新生小鼠原代小胶质细胞,给予LPS+IFN-γ或IL-4刺激,6 h后应用RT-PCR检测M1型标志物或M2型标志物mRNA水平,观察敲除ARRB2对小胶质细胞表型转化的影响。培养WT小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM),转染ARRB1 siRNA 48 h后给予LPS+IFN-γ或IL-4刺激,6 h后应用RT-PCR方法检测M1型标志物或M2型标志物mRNA水平;24 h后收集细胞上清,ELISA检测促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)或抗炎因子(TGF-β、IL-10)蛋白水平;或提取细胞总蛋白,Western Blot检测iNOS或CD206蛋白表达水平;或运用细胞免疫荧光检测CD16或CD206表达水平,观察干扰ARRB1对巨噬细胞表型转化的影响。培养WT和Arrb2~(-/-)小鼠BMDM,给予同样的刺激,运用同样的检测方法观察敲除ARRB2对巨噬细胞表型转化的影响。培养WT小鼠BMDM,转染pcDNA-Arrb1或者pcDNA-Arrb2质粒,24 h后运用Western Blot检测过表达效率。转染相应质粒的BMDM给予LPS+IFN-γ或IL-4刺激,6 h后应用RT-PCR方法检测M1型标志物或M2型标志物mRNA水平,观察过表达ARRB1或ARRB2对巨噬细胞表型转化的影响。干扰ARRB1或敲除ARRB2的小胶质细胞给予LPS+IFN-γ刺激,24 h后收集小胶质细胞CM刺激中脑原代神经元,24 h后运用CCK8、Hoechst33342染色、Western Blot、TH免疫细胞化学染色方法观察神经元损伤情况。结果:1)LPS+IFN-γ刺激升高ARRB1表达而降低ARRB2表达,与之相反,IL-4刺激降低ARRB1表达而升高ARRB2表达;2)干扰ARRB1表达抑制LPS+IFN-γ刺激引起的M1型小胶质细胞标志物的mRNA水平(Il-6、Il-1b、Tnf、Nos2)升高,并促进IL-4引起的M2型小胶质细胞标志物的mRNA水平(Arg1、Ym1、Mrc1)升高;3)敲除ARRB2增加LPS+IFN-γ刺激引起的M1型小胶质细胞标志物的mRNA水平升高,并降低IL-4引起的M2型小胶质细胞标志物的mRNA水平升高;4)下调ARRB1抑制LPS+IFN-γ刺激引起的M1型巨噬细胞标志物的mRNA水平和蛋白水平(IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS、CD16)升高,并促进IL-4引起的M2型巨噬细胞标志物的mRNA水平和蛋白水平(CD206、TGF-β、IL-10)升高;5)过表达ARRB1促进LPS+IFN-γ刺激引起的M1型巨噬细胞标志物的mRNA水平升高,并抑制IL-4引起的M2型巨噬细胞标志物的mRNA水平升高;6)ARRB2敲除增加LPS+IFN-γ刺激引起的M1型巨噬细胞标志物的mRNA水平和蛋白水平升高,并降低IL-4引起的M2型巨噬细胞标志物的mRNA水平和蛋白水平升高;7)过表达ARRB2抑制LPS+IFN-γ刺激引起的M1型巨噬细胞标志物的mRNA水平升高,并促进IL-4引起的M2型巨噬细胞标志物的mRNA水平升高;8)下调小胶质细胞ARRB1减轻M1型小胶质细胞CM引起的中脑神经元损伤;9)敲除小胶质细胞ARRB2加剧M1型小胶质细胞CM引起的中脑神经元损伤。结论:ARRB1和ARRB2在调节小胶质细胞/巨噬细胞极化中起着重要但相反的作用,该作用可以影响多巴胺能神经元存活。第三部分β-Arrestin1/2调节小胶质细胞/巨噬细胞极化的机制和相互关系的研究目的:研究ARRBs调节小胶质细胞/巨噬细胞极化及发挥相反作用的分子机制。方法:培养WT小鼠BMDM,转染ARRB1 siRNA或者ARRB2 siRNA 48 h后给予LPS(100 ng/ml)+IFN-γ(20 ng/ml)或IL-4(20 ng/ml)刺激,2 h后应用Western Blot检测IKKβ、p65、STAT1或者STAT6的磷酸化和总蛋白表达水平,观察干扰ARRB1或ARRB2对NF-κB、STAT1、STAT6通路的影响。培养WT小鼠BMDM,给予LPS+IFN-γ或IL-4刺激,1 h后提取细胞总蛋白,运用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测ARRB1或ARRB2与IKKβ、p65、STAT1或者STAT6结合情况。培养WT小鼠BMDM,转染ARRB1 siRNA或者ARRB2 siRNA,48 h后给予LPS+IFN-γ刺激,1 h后提取细胞总蛋白,运用Co-IP检测ARRB2或ARRB1与p65结合情况。培养WT和Arrb2~(-/-)新生小鼠原代小胶质细胞,给予LPS+IFN-γ或IL-4刺激,6 h后提取细胞总RNA进行转录组学测序,经筛选分析、RT-PCR验证、干扰蛋白表达,找到ARRB1和ARRB2发挥相反调节作用的关键分子。结果:1)干扰ARRB1抑制LPS+IFN-γ刺激引起的IKKβ、p65和STAT1蛋白的磷酸化水平升高,促进IL-4刺激引起的STAT6蛋白的磷酸化水平升高;2)干扰ARRB2促进LPS+IFN-γ刺激引起的IKKβ、p65、STAT1蛋白的磷酸化水平升高,抑制IL-4刺激引起的STAT6蛋白的磷酸化水平升高;3)ARRB1和ARRB2在LPS+IFN-γ刺激下均与p65发生结合,ARRB1和ARRB2均不与IKKβ、STAT1、STAT6结合;4)干扰ARRB1增强LPS+IFN-γ刺激下ARRB2与p65的结合,反之,干扰ARRB2增强LPS+IFN-γ刺激下ARRB1与p65的结合;5)干扰ARRB1和敲除ARRB2的M1型小胶质细胞中Il12rb1、Lpar1、Nprl3变化趋势相反,干扰ARRB1下调这三种基因表达,敲除ARRB2上调这三种基因表达;6)干扰ARRB1和敲除ARRB2的M2型小胶质细胞中Samd4变化趋势相反,干扰ARRB1上调Samd4基因表达,敲除ARRB2下调Samd4基因表达;7)干扰Nprl3进一步增强ARRB1敲除对M1型小胶质细胞极化的抑制作用而部分取消ARRB2敲除对M1型小胶质细胞极化的促进作用;8)干扰Samd4部分取消ARRB1敲除对M2型小胶质细胞极化的促进作用而进一步增强ARRB2敲除对M2型小胶质细胞极化的抑制作用。结论:ARRB1和ARRB2通过差异调节Nprl3和Samd4的表达以及NF-κB、STAT1和STAT6通路的活化从而在小胶质细胞/巨噬细胞表型转化中发挥相反的作用。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.发现ARRB1和ARRB2在PD发生中具有至关重要且相反的作用本研究发现,ARRB1敲除减轻PD小鼠中脑SNc区多巴胺能神经元丢失、胶质细胞增殖活化,而ARRB2敲除加重PD小鼠中脑SNc区多巴胺能神经元丢失、胶质细胞增殖活化。提示ARRB1与ARRB2都参与PD发生,且作用相反,为靶向GPCRs或者ARRBs的PD药物研发提供理论依据。2.阐明ARRBs通过调节小胶质细胞表型转化影响多巴胺能神经元存活本研究表明,干扰ARRB1抑制M1型并促进M2型小胶质细胞极化,从而减轻M1型小胶质细胞CM引起的多巴胺能神经元损伤;敲除ARRB2促进M1型并抑制M2型小胶质细胞极化,从而加重M1型小胶质细胞CM引起的多巴胺能神经元损伤。这些结果表明ARRBs通过调节小胶质细胞表型转化影响多巴胺能神经元存活从而参与PD的病理过程,为研发靶向于小胶质细胞表型调节的神经保护剂提供了实验依据。3.阐明ARRBs调节小胶质细胞表型转化的分子机制本研究揭示,Nprl3是ARRB1和ARRB2在M1型小胶质细胞表型转化中发挥相反作用的关键分子,Samd4是ARRB1和ARRB2在M2型小胶质细胞表型转化中发挥相反作用的关键分子,为靶向小胶质细胞表型调节的药物研发提供重要靶点。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.5
【文章目录】：英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 β-Arrestin1/2与帕金森病发生的相关性研究
材料与方法
结果
讨论
结论
第二部分 β-Arrestin1/2对小胶质细胞极化的调节及其对神经元的影响
材料与方法
结果
讨论
结论
第三部分 β-Arrestin1/2调节小胶质细胞/巨噬细胞极化的机制和相互关系的研究
材料与方法
结果
讨论
结论
结语
参考文献
附录 综述
参考文献
附录 在读期间发表的与本论文相关的文章
致谢
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