研究背景和研究目的帕金森病(Parkinson's disease,PD)是全球范围内一种常见的中枢神经系统退行性病变,其发病率和患病率仅次于老年痴呆症。帕金森病的发病与年龄因素相关,老年患者多见,50岁之前的患者比较罕见。在超过60岁的人群中,帕金森病的患病率和发病率都迅速增加。研究表明,50-59岁人群帕金森病的患病率为107/10万人,而70-79岁人群的帕金森病患病率可达到1087/10万人。帕金森病的发病过程是一个慢性过程,早期帕金森病患者症状主要以非运动症状为主,表现为嗅觉功能障碍、睡眠障碍、疼痛症状、疲倦、精神症状、认知障碍以及自主神经功能障碍等。随着病情的进展加重,帕金森病患者出现典型的运动症状,包括走路步态不稳、肌张力增高、运动迟缓以及静止性震颤等。帕金森病给社会带来严重的经济损失,同时也造成帕金森病患者生活质量下降。因此帕金森病已经成为危害人类健康的主要疾病之一。帕金森病的进展过程是一个长期的阶段,从早期非运动症状出现到后期典型的运动功能障碍可以持续若干年,这段时期我们称之为运动症状前驱期。有学者研究表明运动前驱期整个过程是帕金森病的病理发展的早期过程,早期阶段黑质纹状体系统多巴胺能神经元受影响小,并且机体存在相应的代偿机制,因此运动症状不明显。当黑质部位的多巴胺能神经元减少在50%以上,以及纹状体多巴胺水平减少在70%以上时,典型的运动症状和全身症状开始出现,帕金森病发展进入晚期阶段。运动症状前驱期是帕金森病的治疗宝贵时机,有效的预防和治疗方法可以延缓甚至逆转帕金森病的进展。帕金森病是一种复杂的神经系统病变,其具体的发病机制目前尚不明确。遗传因素、环境因素、年龄因素以及颅脑创伤病史等因素均与帕金森病发病有关。目前大量的流行病学和毒理学研究表明,环境因素特别是环境中各种神经毒素与帕金森病的发病和进展密切相关。帕金森病的发病和进展主要有两方面因素的参与,一是随着年龄的增加,多巴胺能神经元自发出现衰老死亡的情况。另外就是环境中的神经毒素加速了多巴胺能神经元衰老死亡的过程,使多巴胺能神经元损失速度明显加快。MPTP是最早被发现的可以导致帕金森病的神经毒素,也正是MPTP的发现才引起人们对环境因素与帕金森病相关性的重视。MPTP本身没有神经毒性,但MPTP在人体内被代谢为MPP+,MPP+在体内主要的破坏目标就是多巴胺能神经元,抑制氧化呼吸链的线粒体复合物I的功能,从而使多巴胺能神经元线粒体功能受损而发生氧化应激。自从MPTP发现以来,越来越多的MPTP类似物被发现,包括除草剂、生物碱以及β-咔啉类。本次课题研究的TaClo就是属于β-咔啉类,与MPP+有着类似的结构。TaClo是三氯乙烯在体内的代谢产物,并且因为三氯乙烯和TaClo均具有较好的脂溶性,比MPTP更容易被动的通过各种生物膜,TaClo的神经毒性与MPP+相比更强。1995年,BringmannG.等首次发现TaClo可以导致帕金森病症状。TaClo在体内由生物胺色胺(Ta)和三氯乙醛(Clo)自发合成,其中三氯乙醛是由三氯乙烯在体内代谢产生的。三氯乙烯是一种常用的工业有机溶剂,经常被应用于农药、萃取剂以及洗涤剂等。自然环境中三氯乙烯的污染主要来源于工业废水的随意排放和空气污染,长期的接触三氯乙烯可以导致TaClo在人体内自发合成。Kochen W.等追踪研究了三位长期接触三氯乙烯的帕金森病患者,发现三位患者血液内TaClo水平均达到了纳克级别。Gash DM.等也报道30名暴露于三氯乙烯长达8-33年不等的工人均患上了帕金森病。由于TaClo在体内自发合成以后就难以代谢出体外,TaClo在机体内的含量就会随着暴露时间延长而升高,当TaClo的神经毒性作用积累到一定程度时,就会导致帕金森病典型的运动症状。BringmannG.进一步对TaClo进行体内研究发现TaClo破坏黑质纹状体系统多巴胺能神经元与其破坏氧化呼吸链上线粒体复合物I有关。自TaClo的神经毒性被发现以来,迅速引起了广泛关注,许多体外和体内实验证实了TaClo可以破坏黑质纹状体系统,导致多巴胺能神经元减少,诱导帕金森病症状的出现。目前关于TaClo导致帕金森病发病机制的研究主要认为TaClo抑制线粒体复合物I,诱导活性氧簇的产生,抑制线粒体功能有关。Bing G.等研究发现,每天给予C57BL/6小鼠灌胃三氯乙烯,8个月后小鼠黑质部位多巴胺能神经元减少,并伴随着小鼠黑质部位出现小胶质细胞活化的病理改变,并且这些病理改变并不是由TCE直接导致,而是由TCE在小鼠体内代谢产物TaClo导致的。但是,综合起来看TaClo具体如何破坏黑质纹状体系统,导致多巴胺能神经元丢失的分子生物学机制以及TaClo诱导黑质纹状体系统出现的病理改变过程仍缺乏进一步的研究。本项研究通过体外和体内实验对TaClo通过何种途径引起多巴胺能神经元减少以及如何参与到帕金森病的病理发展过程进行了初步研究,旨在为探求帕金森病的预防和治疗方法提供新的思路。研究内容第一部分:通过体外实验研究TaClo对多巴胺能细胞系SH-SH5Y的细胞毒性作用,并研究TaClo引起细胞发生凋亡的途径。第二部分:利用立体定向注射技术构建TaClo大鼠帕金森病模型,探索在体内环境下TaClo对黑质纹状体系统的毒性作用以及TaClo引起的病理改变,并初步研究抗氧化剂NAC对抗TaClo神经毒性的效果。研究方法第一部分:1.利用CCK-8和细胞活力检测方法,检测TaClo对SH-SH5Y细胞系的细胞毒性作用,利用线粒体ROS荧光染色试剂盒以及线粒体膜电位JC-1染色试剂盒检测不同浓度刺激下SH-SH5Y细胞系发生线粒体氧化应激以及线粒体膜电位的情况。2.利用流式细胞术和TUNEL染色,检测TaClo诱导SH-SH5Y发生凋亡的情况。3.利用Western Blot技术研究TaClo诱导SH-SH5Y发生凋亡的途径和机制。第二部分:1.利用GEO公共数据库中关于帕金森病患者黑质部位基因差异性表达的数据集(GSE7621-GPL570),对帕金森病患者发病与氧化应激和炎性反应相关基因表达的关系进行分析。2.利用立体定向注射技术将TaClo注射到雄性Wistar大鼠右侧纹状体部位,对照组大鼠注射溶剂。利用旷场实验对Wistar大鼠模型进行行为学检测,并在造模后第28天利用液相色谱质谱联用技术对模型大鼠纹状体多巴胺神经递质水平进行检测,以此判断Wistar大鼠帕金森病模型是否造模成功。3.利用Western blot、免疫荧光以及免疫组化染色实验方法分别检测实验组和对照组大鼠黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞的减少情况,并通过Nissl染色技术观察神经损伤情况。4.利用流式细胞术通检测实验组和对照组黑质纹状体系统TH+细胞ROS水平,同时对黑质部位进行JC-1染色,观察TaClo对线粒体膜电位的影响。5.利用免疫组化染色、RT-PCR以及western blot检测黑质部位小胶质细胞活化情况以及IL-6、TNF-a、iNOS、Cox-2炎性因子表达情况和细胞凋亡蛋白Caspase-3及活化Caspase-3的表达情况。6.利用弥散张量成像技术,对大鼠黑质纹状体通路系统进行神经纤维示踪,并对黑质纹状体系统神经纤维的ADC和FA值进行对比分析,在活体情况下检测TaClo对大鼠黑质纹状体通路的毒性作用。并利用LFB方法对黑质部位进行神经纤维髓鞘进行染色,观察神经髓鞘变化情况。7.对构建成功的Wistar大鼠帕金森病模型给予抗氧化剂NAC干预后,利用western blot技术对NAC干预后的大鼠黑质部位炎性因子水平以及凋亡蛋白变化进行分析,初步研究抗氧化剂NAC对抗TaClo神经毒性的效果。研究结果第一部分:1.TaClo以浓度梯度的方式抑制SH-SH5Y细胞的增殖和细胞活力,并诱导SH-SH5Y细胞系发生线粒体氧化应激,使细胞线粒体ROS水平升高,并且使线粒体膜电位下降。2.流式细胞术显示TaClo诱导SH-SH5Y细胞发生凋亡的比例增加,同时TUNEL染色结果也显示TaClo诱导SH-SH5Y细胞发生凋亡。3.Western blot结果显示TaClo诱导SH-SH5Y细胞Bax/Bcl-2比例增加,同时诱导Caspase-9以及Caspase-3活化,给予NAC抑制ROS后可以对抗TaClo的作用,说明TaClo诱导SH-SH5Y细胞发生线粒体凋亡。第二部分:1.通过分析GEO公共数据库中关于帕金森病患者黑质部位基因差异性表达的数据集(GSE7621-GPL570),发现帕金森病患者黑质部位一些炎性因子与正常对比表达升高,包括IL-6、iNOS、Cox-2、NF-κB。同时与氧化应激相关的一些基因的表达水平也明显升高,包括GABPA和Keap 1。这些结果说明氧化应激和炎性反应与帕金森病发病相关。2.行为学检测结果显示造模手术后第21天和第28天,实验组大鼠运动轨迹明显少于对照组大鼠,并且实验组大鼠出现运动迟缓症状,运动范围逐渐缩小。对实验组和对照组大鼠纹状体多巴胺水平检测结果显示实验组大鼠多巴胺水平明显低于对照组,据此判断大鼠帕金森病模型造模成功。3.Western blot和免疫荧光以及免疫组化染色结果显示实验组大鼠黑质部位TH+阳性细胞显著减少。同时Niss1染色结果显示实验组黑质部位Niss1小体减少,说明TaClo造成黑质部位神经损伤以及多巴胺能神经元细胞的减少。4.流式细胞术检测显示实验组大鼠黑质TH+细胞的ROS水平与对照组相比显著升高,同时JC-1染色结果显示实验组大鼠黑质部位线粒体膜电位下降,结果说明TaClo诱导多巴胺能神经元发生线粒体氧化应激,同时造成黑质部位发生早期凋亡。5.1ba-l免疫组化染色结果显示TaClo诱导黑质部位小胶质细胞发生激活,同时RT-PCR和western blot结果显示实验组大鼠黑质部位炎性因子IL-6、TNF-a、iNOS以及Cox-2在基因转录和蛋白表达水平与对照组相比均升高。结果说明TaClo诱导大鼠黑质部位发生炎性反应。6.弥散张量成像技术对黑质纹状体通路神经纤维示踪结果显示,实验组大鼠黑质纹状体通路神经纤维明显减少,对黑质纹状体通路神经纤维进行参数分析显示实验组ADC值显著升高,说明神经纤维横向水分子弥散增加,与神经纤维发生脱髓鞘改变相关。LFB神经髓鞘染色结果显示实验组大鼠黑质部位发生脱髓鞘改变。这些结果说明TaClo诱导帕金森病与其造成黑质纹状体系统神经元脱髓鞘的病理改变相关。7.Western blot结果显示NAC干预可以对抗TaClo的神经毒性作用,减少炎性因子水平,同时降低凋亡相关蛋白的表达,初步证实抗氧化剂对抗TaClo神经毒性的效果。结论1.在体外环境下,TaClo激活内源性线粒体凋亡途径诱导SH-SH5Y细胞发生凋亡。ROS抑制剂可以减轻TaClo导致的细胞凋亡并且抑制TaClo诱导线粒体凋亡途径的激活。2.在体内环境下,神经毒素TaClo通过介导氧化应激和炎性反应共同参与了帕金森病的进展过程。TaClo诱导的多巴胺能神经元线粒体氧化应激以及小胶质细胞异常激活促进了多巴胺能神经元凋亡。ROS抑制剂NAC的使用可以减轻TaClo诱导的炎性反应和细胞凋亡。3.TaClo诱导黑质纹状体通路神经纤维发生脱髓鞘病理改变,进而导致纹状体部位多巴胺水平下降,诱导帕金森病典型运动症状的出现。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.5
【部分图文】：
２４ｈ??图４?ＳＨ－ＳＨ５Ｙ细胞线粒体ＲＯＳ水平检测利用１００?ｙ?Ｍ的ＴａＣｌｏ处理ＳＨ－ＳＨ５Ｙ??细胞后发现，细胞线粒体的ＲＯＳ水平随ＴａＣｌｏ刺激时间的增加而升高。当ＴａＣｌｏ??处理２４小时后，线粒体ＲＯＳ水平与对照组细胞相比明显增加，说明ＴａＣｌｏ诱导??细胞发生明显的线粒体氧化应激。??３９??
图５?ＳＨ－ＳＨ５Ｙ细胞厶的！！检测Ａ中ｍ正常时，ＪＣ－１会以聚合物的形式集中在??线粒体基质中，发出红色的荧光。当Ａ＾Ｆｍ下降时，ＪＣ－１以单体的形式存在，可??以发出绿色荧光，因此可以用红绿荧光的相对比例来观察ＡＴｍ的变化。１００?ｕ??Ｍ的ＴａＣｌｏ处理ＳＨ－ＳＨ５Ｙ细胞，我们发现随着处理时间的增加，ＪＣ－１染色后线??粒体的红色荧光逐渐减弱，而绿色荧光逐渐增加，说明ＴａＣｌｏ处理造成ＳＨ－ＳＨ５Ｙ??细胞么平！！！下降。??
图６?ＴａＣｌｏ诱导ＳＨ－ＳＨ５Ｙ细胞发生凋亡流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，１００??ｙ?ＭＴａＣｌｏ处理ＳＨ－ＳＨ５Ｙ细胞２４小时后，发生凋亡的细胞比例与对照组相比明显??增加，差异具有统计学意义。当同时给予ＲＯＳ抑制剂ＮＡＣ干预后，发现ＴａＣｌｏ??诱导凋亡的细胞比例与ＴａＣｌｏ组发生凋亡的细胞比例相比下降。??
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