XIST、G3BP2和NFAT5调控胶质母细胞瘤血管新生的机制研究
发布时间：2020-12-07 22:45
目的:胶质母细胞瘤是颅内恶性度最高的原发性肿瘤。胶质母细胞瘤的临床治疗手段主要包括手术切除以及术后的放疗、化疗。然而,胶质母细胞瘤患者的中位生存期并未随着医疗技术的改善而相应的延长。血管新生促进胶质母细胞瘤的演进,因此靶向胶质母细胞瘤血管新生的治疗方案有潜在的应用前景。然而血肿瘤屏障的存在,极大地限制了大分子化疗药物进入肿瘤组织,降低了疗效。因此增加血肿瘤屏障通透性并抑制胶质瘤血管新生可能成为一种更有效的胶质瘤治疗手段。胶质母细胞瘤内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成是内皮细胞依赖性血管新生的重要过程。同时,胶质母细胞瘤内皮细胞是血肿瘤屏障的重要结构基础。因此靶向调节胶质母细胞瘤内皮细胞的生物学行为可能调控胶质母细胞瘤的血管新生及血肿瘤屏障的通透性。敲减长链非编码RNA XIST,抑制胶质瘤干细胞的增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡。而XIST是否调控胶质母细胞瘤内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成及血肿瘤屏障通透性未见文献报道。RNA结合蛋白G3BP2可调控肝细胞癌和乳腺癌的生物学行为。而G3BP2在胶质母细胞瘤内皮细胞中的调控作用未见文献报道。胶质母细胞瘤细胞分泌大量促血管生成因子,从而营造了强烈的...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 长链非编码RNAXIST通过靶向miR-137调节血肿瘤屏障通透性和胶质瘤母细胞瘤血管新生的机制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验细胞株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞冻存
2.2.3 细胞复苏
2.2.4 细胞计数
2.2.5 体外血肿瘤屏障模型的建立
2.2.6 Trizol法提取RNA
2.2.7 Real-timePCR方法分别检测XIST、miR-137及FOXC1mRNA的表达变化
2.2.8 细胞转染
2.2.9 双荧光素酶报告基因检测
2.2.10 跨内皮阻抗值（TEER）的测量
2.2.11 辣根过氧化物酶（HRP）渗出量的测定
2.2.12 内皮细胞生长抑制实验（CCK-8法）
2.2.13 内皮细胞迁移实验
2.2.14 内皮细胞管腔形成实验
2.2.15 Westernblot
2.2.16 免疫荧光
2.2.17 RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）
2.2.18 染色质免疫共沉淀（CHIP）实验
2.3 统计方法
3 实验结果
3.1 XIST在GECs中高表达,在GECs中敲减XIST的表达增加BTB通透性并抑制胶质母细胞瘤血管新生
3.2 XIST结合miR-137,XIST与miR-137相互负性抑制
3.3 miR-137参与XIST对BTB通透性和胶质母细胞瘤血管新生的调控
3.4 miR-137在GECs中低表达,过表达miR-137增加BTB通透性,抑制胶质母细胞瘤血管新生
3.5 miR-137靶向调节ZO-2和FOXC1的表达
3.6 FOXC1在GECs中高表达,敲减FOXC1的表达增加BTB通透性并抑制胶质母细胞瘤血管新生
3.7 过表达FOXC1通过结合ZO-1、occludin和CXCR7的启动子区促进上述蛋白的表达
3.8 FOXC1参与miR-137对BTB通透性和胶质瘤血管新生的调控。
4 讨论
5 结论
第二部分 ：RNA结合蛋白G3BP2通过增加HEIH的稳定性促进胶质母细胞瘤内皮细胞血管新生机制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.2.2 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）
2.2.3 构建稳定转染稳转G3BP2、HEIH、IRF6、CYR61过表达及表达沉默的细胞系及分组
2.2.4 胶质母细胞瘤条件培养基的制备
2.2.5 内皮细胞生长抑制实验（CCK-8法）、内皮细胞迁移实验及内皮细胞管腔形成实验
2.2.6 Westernblot
2.2.7 染色质免疫沉淀（ChIP）
2.2.8 基质胶栓体内血管生成实验
2.3 统计方法
3 实验结果
3.1 G3BP2在GECs中高表达,敲减G3BP2抑制GECs的细胞活力、迁移及管腔形成
3.2 敲减G3BP2下调GECs中HEIH的表达水平,并降低HEIH的稳定性
3.3 HEIH在GECs中高表达,过表达HEIH促进GECs的细胞活力、迁移及管腔形成
3.4 HEIH参与了G3BP2对GECs细胞活力、迁移及管腔形成等生物学行为的调控
3.5 HEIH以SMD的方式下调IRF6的表达
3.6 IRF6在GECs低表达,过表达IRF6抑制GECs的细胞活力、迁移及管腔形成能力
3.7 HEIH通过靶向IRF6的3'-UTR区促进GECs血管新生
3.8 IRF6在转录水平抑制CYR61的表达
3.9 CYR61在GECs高表达,敲减CYR61抑制GECs血管新生
3.10 联合敲减G3BP2及HEIH的表达抑制体内GECs血管新生
4 讨论
5 结论
第三部分 ：转录因子NFAT5调节SBF2-AS1/miR-338-3p介导的EGFL7的表达改变促进胶质母细胞瘤诱导的血管新生机制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.2.2 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）
2.2.3 构建稳定转染稳转NFAT5、SBF2-AS1表达沉默的细胞系及分组
2.2.4 瞬转miR-338-3p过表达与沉默及分组
2.2.5 SBF2-AS1与miR-338-3p共转染
2.2.6 稳转EGFL7过表达细胞系,随后与miR-338-3p双重转染
2.2.7 胶质瘤条件培养基的制备
2.2.8 内皮细胞生长抑制实验（CCK-8法）、内皮细胞迁移实验及内皮细胞管腔形成实验
2.2.9 Westernblot
2.2.10 双荧光素酶报告基因表达分析
2.2.11 染色质免疫沉淀（ChIP）
2.2.12 裸鼠皮下移植瘤实验
2.3 统计学方法
3 实验结果
3.1 NFAT5的表达水平与胶质瘤的WHO临床分级正相关
3.2 敲减U87及U118细胞中的NFAT5的表达,抑制胶质母细胞瘤细胞诱导的血管新生
3.3 SBF2-AS1在胶质瘤中高表达,敲减U87及U118细胞中的SBF2-AS1的表达,抑制胶质母细胞瘤细胞诱导的体外血管新生
3.4 NFAT5在转录水平促进SBF2-AS1的表达
3.5 SBF2-AS1参与了NFAT5对胶质母细胞瘤细胞诱导的血管新生的调控
3.6 SBF2-AS1吸附miR-338-3p,而miR-338-3p参与了SBF2-AS1对胶质母细胞瘤细胞诱导的血管新生的调控
3.7 上调miR-338-3p通过靶向EGFL7的3’UTR区抑制EGFL7的表达及分泌
3.8 上调miR-338-3p通过靶向EGFL7的3’-UTR区抑制EGFL7诱导的胶质母细胞瘤血管新生
3.9 敲减NFAT5及SBF2-AS1的表达抑制U87及U118细胞中EGFL7的表达及分泌,但不影响EGFL7的mRNA水平
3.10 联合敲减NFAT5及SBF2-AS1抑制胶质母细胞瘤移植瘤生长的效果最显著
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介
本文编号：2904013
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 长链非编码RNAXIST通过靶向miR-137调节血肿瘤屏障通透性和胶质瘤母细胞瘤血管新生的机制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验细胞株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞冻存
2.2.3 细胞复苏
2.2.4 细胞计数
2.2.5 体外血肿瘤屏障模型的建立
2.2.6 Trizol法提取RNA
2.2.7 Real-timePCR方法分别检测XIST、miR-137及FOXC1mRNA的表达变化
2.2.8 细胞转染
2.2.9 双荧光素酶报告基因检测
2.2.10 跨内皮阻抗值（TEER）的测量
2.2.11 辣根过氧化物酶（HRP）渗出量的测定
2.2.12 内皮细胞生长抑制实验（CCK-8法）
2.2.13 内皮细胞迁移实验
2.2.14 内皮细胞管腔形成实验
2.2.15 Westernblot
2.2.16 免疫荧光
2.2.17 RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）
2.2.18 染色质免疫共沉淀（CHIP）实验
2.3 统计方法
3 实验结果
3.1 XIST在GECs中高表达,在GECs中敲减XIST的表达增加BTB通透性并抑制胶质母细胞瘤血管新生
3.2 XIST结合miR-137,XIST与miR-137相互负性抑制
3.3 miR-137参与XIST对BTB通透性和胶质母细胞瘤血管新生的调控
3.4 miR-137在GECs中低表达,过表达miR-137增加BTB通透性,抑制胶质母细胞瘤血管新生
3.5 miR-137靶向调节ZO-2和FOXC1的表达
3.6 FOXC1在GECs中高表达,敲减FOXC1的表达增加BTB通透性并抑制胶质母细胞瘤血管新生
3.7 过表达FOXC1通过结合ZO-1、occludin和CXCR7的启动子区促进上述蛋白的表达
3.8 FOXC1参与miR-137对BTB通透性和胶质瘤血管新生的调控。
4 讨论
5 结论
第二部分 ：RNA结合蛋白G3BP2通过增加HEIH的稳定性促进胶质母细胞瘤内皮细胞血管新生机制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.2.2 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）
2.2.3 构建稳定转染稳转G3BP2、HEIH、IRF6、CYR61过表达及表达沉默的细胞系及分组
2.2.4 胶质母细胞瘤条件培养基的制备
2.2.5 内皮细胞生长抑制实验（CCK-8法）、内皮细胞迁移实验及内皮细胞管腔形成实验
2.2.6 Westernblot
2.2.7 染色质免疫沉淀（ChIP）
2.2.8 基质胶栓体内血管生成实验
2.3 统计方法
3 实验结果
3.1 G3BP2在GECs中高表达,敲减G3BP2抑制GECs的细胞活力、迁移及管腔形成
3.2 敲减G3BP2下调GECs中HEIH的表达水平,并降低HEIH的稳定性
3.3 HEIH在GECs中高表达,过表达HEIH促进GECs的细胞活力、迁移及管腔形成
3.4 HEIH参与了G3BP2对GECs细胞活力、迁移及管腔形成等生物学行为的调控
3.5 HEIH以SMD的方式下调IRF6的表达
3.6 IRF6在GECs低表达,过表达IRF6抑制GECs的细胞活力、迁移及管腔形成能力
3.7 HEIH通过靶向IRF6的3'-UTR区促进GECs血管新生
3.8 IRF6在转录水平抑制CYR61的表达
3.9 CYR61在GECs高表达,敲减CYR61抑制GECs血管新生
3.10 联合敲减G3BP2及HEIH的表达抑制体内GECs血管新生
4 讨论
5 结论
第三部分 ：转录因子NFAT5调节SBF2-AS1/miR-338-3p介导的EGFL7的表达改变促进胶质母细胞瘤诱导的血管新生机制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.2.2 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）
2.2.3 构建稳定转染稳转NFAT5、SBF2-AS1表达沉默的细胞系及分组
2.2.4 瞬转miR-338-3p过表达与沉默及分组
2.2.5 SBF2-AS1与miR-338-3p共转染
2.2.6 稳转EGFL7过表达细胞系,随后与miR-338-3p双重转染
2.2.7 胶质瘤条件培养基的制备
2.2.8 内皮细胞生长抑制实验（CCK-8法）、内皮细胞迁移实验及内皮细胞管腔形成实验
2.2.9 Westernblot
2.2.10 双荧光素酶报告基因表达分析
2.2.11 染色质免疫沉淀（ChIP）
2.2.12 裸鼠皮下移植瘤实验
2.3 统计学方法
3 实验结果
3.1 NFAT5的表达水平与胶质瘤的WHO临床分级正相关
3.2 敲减U87及U118细胞中的NFAT5的表达,抑制胶质母细胞瘤细胞诱导的血管新生
3.3 SBF2-AS1在胶质瘤中高表达,敲减U87及U118细胞中的SBF2-AS1的表达,抑制胶质母细胞瘤细胞诱导的体外血管新生
3.4 NFAT5在转录水平促进SBF2-AS1的表达
3.5 SBF2-AS1参与了NFAT5对胶质母细胞瘤细胞诱导的血管新生的调控
3.6 SBF2-AS1吸附miR-338-3p,而miR-338-3p参与了SBF2-AS1对胶质母细胞瘤细胞诱导的血管新生的调控
3.7 上调miR-338-3p通过靶向EGFL7的3’UTR区抑制EGFL7的表达及分泌
3.8 上调miR-338-3p通过靶向EGFL7的3’-UTR区抑制EGFL7诱导的胶质母细胞瘤血管新生
3.9 敲减NFAT5及SBF2-AS1的表达抑制U87及U118细胞中EGFL7的表达及分泌,但不影响EGFL7的mRNA水平
3.10 联合敲减NFAT5及SBF2-AS1抑制胶质母细胞瘤移植瘤生长的效果最显著
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
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综述
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攻读学位期间取得的研究成果
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个人简介
本文编号：2904013
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