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锰通过BNIP3介导的氧化应激诱导多巴胺能神经元线粒体自噬

发布时间:2020-12-14 04:15
  目的探讨线粒体自噬受体蛋白BNIP3是否通过调节ROS生成介导MnCl2诱导具有多巴胺能作用的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞发生线粒体自噬。方法⑴.细胞毒性检测:取对数生长期的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,使用细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK-8检测不同时间及不同浓度MnCl2作用下SH-SY5Y细胞的细胞活力;使用流式细胞仪检测MnCl2作用下SH-SY5Y细胞线粒体膜电位改变情况。⑵.MnCl2诱导SH-SY5Y细胞线粒体自噬检测:经MnCl2处理24h后采用蛋白免疫印记法检测线粒体自噬受体蛋白BNIP3、线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达量及自噬标记蛋白LC3-I向LC3-II的转化情况;应用透射电子显微镜直接观察MnCl2作用下SH-SY5Y细胞的线粒体形态改变情况及线粒体自噬是否发生;应用自噬抑制剂3-MA反证MnCl2作用下SH-SY5Y细胞内线粒体自噬体是否形成;使用荧光共聚焦显微镜检测MnCl2

【文章来源】:广西医科大学广西壮族自治区

【文章页数】:78 页

【学位级别】:硕士

【部分图文】:

锰通过BNIP3介导的氧化应激诱导多巴胺能神经元线粒体自噬


哺乳动物中线粒体自噬的相关调控通路Figure1:Mitophagyassociatedregulatorypathwayinanimals

活力,情况,线粒体膜电位,细胞的


2作用后 SH-SY5Y 的细胞活性,结果表明,与 control 组相比,不同浓度 MnCl2作用 12 小时对 SH-SY5Y 细胞的抑制作用无明显差别,P>0.05,而不同浓度作用于 SH-SY5Y 细胞 24h 及 48h 后,其活性均随 MnCl2浓度逐渐加大而明显降低,均 P<0.01,差异有统计学意义(图 2A),24 小时及 48 小时的IC50 分别为 585.31±139.77μmol/L、345.91±273.18μmol/L,结合以上数据,除特殊情况外,后续实验将以 0、200、400、800μmol/L 或单独以 400μmol/L干预 24h 进行机制研究。此外,为了进一步了解 MnCl2对 SH-SY5Y 细胞的毒性作用,我们通过 JC-1 试剂盒对细胞凋亡早期的标志性事件:线粒体膜电位进行检测,经 200、400、800μmol/L MnCl2干预 24 小时后,control 组及各组线粒体膜电位分别为 1.00±0.02、0.60±0.03、0.23±0.03、0.14±0.01,P<0.01 或 P<0.05(图 2B),说明 MnCl2可致线粒体损伤并诱导 SH-SY5Y细胞发生凋亡。

线粒体膜电位


2作用后 SH-SY5Y 的细胞活性,结果表明,与 control 组相比,不同浓度 MnCl2作用 12 小时对 SH-SY5Y 细胞的抑制作用无明显差别,P>0.05,而不同浓度作用于 SH-SY5Y 细胞 24h 及 48h 后,其活性均随 MnCl2浓度逐渐加大而明显降低,均 P<0.01,差异有统计学意义(图 2A),24 小时及 48 小时的IC50 分别为 585.31±139.77μmol/L、345.91±273.18μmol/L,结合以上数据,除特殊情况外,后续实验将以 0、200、400、800μmol/L 或单独以 400μmol/L干预 24h 进行机制研究。此外,为了进一步了解 MnCl2对 SH-SY5Y 细胞的毒性作用,我们通过 JC-1 试剂盒对细胞凋亡早期的标志性事件:线粒体膜电位进行检测,经 200、400、800μmol/L MnCl2干预 24 小时后,control 组及各组线粒体膜电位分别为 1.00±0.02、0.60±0.03、0.23±0.03、0.14±0.01,P<0.01 或 P<0.05(图 2B),说明 MnCl2可致线粒体损伤并诱导 SH-SY5Y细胞发生凋亡。


本文编号:2915791

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