MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导神经细胞凋亡的影响及机制研究

发布时间：2017-04-08 04:19

  本文关键词：MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导神经细胞凋亡的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 在整体动物水平，研究MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注（MCAO/R）诱导神经细胞凋亡的影响及其机制。 方法： 1、慢病毒介导的MRTF-A（LV-MRTF-A）在大鼠脑皮层中表达的分布及时间相关性的研究：①30只SPF级SD大鼠随机分为5组，以注射阴性慢病毒（NEG-LV）为对照组，其余4组分别脑室注射LV-MRTF-A1μl、2μl、4μl、5μl，于第5d取全脑做石蜡切片，用激光共聚焦显微镜观察MRTF-A表达；②取脑室注射4μl LV-MRTF-A5d的脑组织，激光共聚焦显微镜观察大鼠脑皮层不同部位MRTF-A表达；③36只SPF级SD大鼠随机分为6组，脑室注射LV-MRTF-A后，分别于1d、3d、5d、7d、9d取全脑组织做石蜡切片，激光共聚焦显微镜观察各组脑皮层中MRTF-A表达。 2、MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡的影响：84只SPF级SD大鼠随机分成3组：对照组、模型组、实验组。对照组与模型组分别脑室注射4μlNEG-LV；实验组脑室注射4μl LV-MRTF-A。脑室注射4天后，实验组与模型组分别构建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h、MCAO2h/R72h），用Longa’s法进行神经功能评分；用TTC染色评价脑梗塞体积；用TUNEL法检测细胞凋亡率。 3、MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导神经细胞凋亡作用机制：54只SPF级SD大鼠随机分成3组：对照组、模型组、实验组。对照组与模型组分别脑室注射4μl NEG-LV；实验组脑室注射4μl LV-MRTF-A。脑室注射4天后，实验组与模型组分别构建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h），用Real-time PCR检测脑皮层中MRTF-A、caspase3及Mcl-1mRNA表达；用Western blot检测脑皮层中MRTF-A、CC3及Mcl-1蛋白表达；用免疫荧光法检测脑皮层细胞色素C、Apaf-1、CC3、Mcl-1表达。 结果： 1、LV-MRTF-A在大鼠脑皮层感染剂量研究发现：大鼠脑室注射不同剂量LV-MRTF-A5d后，1μl和2μl组MRTF-A表达较低，与2μl组对比，4μl和5μl组MRTF-A表达明显增加，且两组表达无差异；LV-MRTF-A在大鼠脑皮层中分布研究发现：大鼠脑室注射4μl LV-MRTF-A5d后，MRTF-A在脑皮层中广泛表达，以注射点及其四周表达最高，注射点远端表达量逐渐下降；LV-MRTF-A在大鼠脑皮层中感染时间研究发现：大鼠脑室注射4μl LV-MRTF-A后，1d、3d有少量MRTF-A表达，5d、7d MRTF-A表达相比3d呈明显上升趋势，9d表达量相比7d降低。 2、MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡的影响研究发现：模型组神经功能评分及脑梗死体积与对照组相比有显著性差异（P＜0.01），，实验组神经功能评分及脑梗死体积与模型组的同一再灌注时间点组比较，均显著减少，具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；TUNEL法检测神经细胞凋亡率表明，与对照组比较，模型组凋亡率明显增加（P＜0.05或P＜0.01），且随着再灌注时间延长，凋亡率呈逐渐下降趋势。实验组与模型组的同一再灌注时间点对比，细胞凋亡率均显著下降，且具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。 3、MRTF-A抗大鼠脑缺血再灌注诱导凋亡的机制研究发现：大鼠脑室注射4μlLV-MRTF-A后，大鼠脑皮层中MRTF-A mRNA及蛋白表达显著上升。Real-timePCR结果显示，与对照组比较，模型组caspase-3mRNA表达明显增加，Mcl-1mRNA表达明显下降（P＜0.01）。与模型组对比，实验组caspase-3mRNA表达明显下降，Mcl-1mRNA表达明显增加（P＜0.01）。Western blot结果显示，与对照组比较，模型组CC3蛋白表达明显增加，Mcl-1蛋白表达明显下降（P＜0.01）。与模型组对比，实验组CC3蛋白表达明显下降，Mcl-1蛋白表达明显增加（P＜0.01）；激光共聚焦显微镜观察发现：MCAO2h/R24h诱导cyt C与Apaf-1高表达，且两者表达交集区域范围广，CC3表达明显增加，Mcl-1表达明显下降。脑室注射MRTF-A后，cyt C与Apaf-1表达及交集区域均明显减少；CC3表达明显下降，Mcl-1表达明显增加。 结论： 1、LV-MRTF-A最佳注射剂量为4μl，LV-MRTF-A最强表达时段为注射后第5d-7d，且以注射点为LV-MRTF-A最强表达区域并向皮层四周扩散表达。说明LV-MRTF-A能有效地感染大鼠脑皮层。 2、整体MCAO/R大鼠模型上，脑室注射LV-MRTF-A能够明显抑制脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡，改善神经功能损伤，减少脑梗死体积，其机制可能与MRTF-A降低cytC与Apaf-1的表达及结合，以及下调促凋亡基因caspase3、CC3表达，上调抗凋亡靶基因Mcl-1的表达有关。
【关键词】：慢病毒 MRTF-A 脑缺血再灌注损伤 凋亡
【学位授予单位】：武汉科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文缩写对照表(Abbreviations)11-15
• 前言15-19
• 第一部分19-32
• 1.材料与仪器19-22
• 1.1 实验动物及质粒19-20
• 1.2 心脏灌注试剂20-21
• 1.3 脑组织石蜡包埋及切片相关试剂21
• 1.4 荧光检测相关试剂21-22
• 1.5 实验仪器22
• 2 方法22-25
• 2.1 实验设计22-23
• 2.2 慢病毒质粒的脑室注射23-24
• 2.3 心脏灌注24-25
• 2.4 石蜡切片的制作25
• 2.5 激光共聚焦显微镜检测荧光表达25
• 2.6 统计学分析25
• 3 结果25-31
• 3.1 不同剂量 LV-MRTF-A 在大鼠脑皮层中表达25-27
• 3.2 LV-MRTF-A 在大鼠脑皮层中表达分布27-29
• 3.3 大鼠脑皮层中 LV-MRTF-A 表达时间相关性29-31
• 4.讨论31-32
• 第二部分32-42
• 1 材料与仪器32-34
• 1.1 实验动物分组及处理32
• 1.2 大鼠右侧脑中动脉栓塞（MCAO）模型及心脏灌注相关试剂32-33
• 1.3 TTC 染色及 TUNEL 检测相关试剂33
• 1.4 心脏灌注相关试剂33-34
• 1.5 石蜡包埋及切片相关试剂34
• 1.6 实验仪器34
• 2 方法34-37
• 2.1 实验动物分组及处理34-35
• 2.2 大鼠右侧大脑中动脉阻塞（MCAO）/再灌注损伤模型制作[26]35
• 2.3 神经功能评分35
• 2.4 心脏灌注35
• 2.5 石蜡切片的制作35-36
• 2.6 TTC 染色36
• 2.7 TUNEL 法分析脑皮层神经细胞凋亡率（%）36
• 2.8 统计学分析36-37
• 3 结果37-41
• 3.1 MRTF-A 对大鼠脑神经功能及脑梗死体积的影响37-39
• 3.2 MRTF-A 对 MCAO/R 诱导的大鼠脑神经细胞凋亡的影响39-41
• 4 讨论41-42
• 第三部分42-58
• 1 材料与仪器42-46
• 1.1 实验动物42
• 1.2 大鼠 MCAO 造模及心脏灌注相关试剂42-43
• 1.3 Real-time PCR 相关检测试剂43
• 1.4 western blot 相关试剂43-45
• 1.5 免疫荧光检测相关试剂45
• 1.6 实验仪器45-46
• 2 方法46-51
• 2.1 实验动物分组及处理46
• 2.2 心脏灌注46-47
• 2.3 石蜡切片的制作47
• 2.4 大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型（MCAO）制作47
• 2.5 Real-time PCR 检测47-49
• 2.6 Western blot 检测49-50
• 2.7 免疫荧光检测50
• 2.8 统计学分析50-51
• 3 结果51-56
• 3.1 MRTF-A 对凋亡相关基因 caspase3 、Mcl-1 mRNA 表达的影响51-52
• 3.2 MRTF-A 对凋亡相关基因 CC3 及 Mcl-1 蛋白表达影响52-53
• 3.3 MRTF-A 对 cytC、Apaf-1 、CC3 及 Mcl-1 的表达影响53-56
• 4 讨论56-58
• 结论与展望58-59
• 参考文献59-62
• 致谢62-63
• 综述63-72
• 参考文献67-72
• 附录 1 攻读硕士学位期间发表的论文72-73
• 附录 2 攻读硕士学位期间参加的科研项目73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李志平;姜稳妮;李波;;卒中后抑郁心理干预治疗观察[J];中国实用神经疾病杂志;2009年05期

2 施勤,刘继明,张学光;细胞凋亡的线粒体调控与Bcl-2基因家族[J];上海免疫学杂志;2000年01期

3 王淑艳;张愚;;慢病毒载体的设计及应用进展[J];中国生物工程杂志;2006年11期

  本文关键词：MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导神经细胞凋亡的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：292067