血管增生促进缺血损伤脑内神经血管单元重构的细胞机制研究

发布时间：2021-01-05 06:26

　　在实验性病理条件下,纹状体与皮层等非神经发生区存在神经元新生。大量研究显示缺血损伤能诱导梗塞周边区发生血管增生和神经元新生。在大鼠脑内过表达或注射血管生成蛋白VEGF能同时增加缺血损伤脑内的血管增生和神经元新生。本实验通过纹状体注射pTIE2-GFP质粒示踪GFP免疫阳性（GFP+）内皮来源细胞的分化,研究血管增生在缺血诱导神经元新生中的作用。并通过侧脑室注射VEGF表达质粒和对照质粒观察过表达VEGF对MCAO术后大鼠缺血纹状体内血管增生与神经元新生的作用。随后,采用免疫荧光多标记与激光共聚焦扫描技术检测缺血脑内血管增生、神经元新生与胶质增生的变化。最后,结合免疫荧光多标记与全细胞膜片钳记录进一步分析缺血脑内GFP+细胞形态学和电生理学特性。研究显示,缺血诱导的增生内皮细胞（GFP+）能表达不同类型神经元标记物并具有动作电位发放。实验结果总结如下：1.缺血脑内内皮源性和不同发育时期神经元性蛋白呈时间依赖的表达免疫组化结果显示,MCAO术后3天至2周大鼠缺血纹状体内vWF、nestin、DCX与Tuj-1呈现时间依赖的表达。缺血侧纹状体内vWF+细胞在缺血再灌3天显著增加,再灌1周和2... 

【文章来源】：复旦大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：博士

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目录
缩略语表（按字母顺序）
中文摘要
英文摘要（Abstract）
（一） 前言
（二） 材料与方法
    1. 实验动物与分组
    2. 试剂来源
    3. 仪器设备
    4. 实验方法
        4.1 大鼠左侧大脑中动脉线栓（MCAO）模型
        4.2 质粒的抽提和鉴定
            4.2.1 质粒大量抽提
            4.2.2 酶切鉴定质粒
            4.2.3 琼脂糖凝胶电泳
        4.3 纹状体内质粒注射
        4.4 侧脑室内质粒注射
        4.5 BrdU注射
        4.6 冰冻组织切片的制备
        4.7 脑片的选取
        4.8 免疫组织化学标记
            4.8.1 BrdU免疫组织化学标记
            4.8.2 免疫组织化学单标记（GFP、Pax6、RFP）
            4.8.3 免疫组织化学双标记
                4.8.3.1 BrdU和GFP的免疫组织化学双标记
                4.8.3.2 Pax6和GFP的免疫组织化学双标记
                4.8.3.3 DCX和vWF的免疫组织化学双标记
        4.9 免疫荧光标记和激光共聚焦扫描技术
            4.9.1 免疫荧光单标记（vWF、GFP）
            4.9.2 免疫荧光双标记
                4.9.2.1 GFP与nestin/Tuj-1/MAP-2/DCX/GAD67/D2L/NR1的免疫荧光双标记
                4.9.2.2 GFP与ChAT/CD34的免疫荧光双标记
                4.9.2.3 GFP与Sox2/Pax6/Oligo2的免疫荧光双标记
            4.9.3 免疫荧光三标记
                4.9.3.1 NeuN、vWF与GFAP的免疫荧光三标记
                4.9.3.2 GFP、vWF与CD133的免疫荧光三标记
            4.9.4 激光共聚焦扫描技术
        4.10 膜片钳技术
            4.10.1 大鼠纹状体脑片的制备
            4.10.2 定位和细胞选取
        4.11 海马及皮层原代神经元培养
            4.11.1 胎鼠的选择
            4.11.2 培养用液的选择
            4.11.3 培养步骤
        4.12 免疫细胞化学及免疫荧光
        4.13 免疫印迹（Western blot）
            4.13.1 细胞总蛋白的制备
            4.13.2 Western blot
        4.14 免疫沉淀（IP）
    5. 细胞计数
    6. 数据的分析与统计
（三） 实验结果
    1. 缺血脑内神经元新生与血管构成之间存在密切联系
        1.1 缺血损伤诱导纹状体血管增生
        1.2 缺血损伤诱导纹状体神经元新生
        1.3 缺血损伤诱导的神经元新生与血管构成之间有密切的联系
        1.4 缺血损伤脑内神经血管单元的重塑
    2. 缺血脑内内皮来源的细胞参与神经元新生
        2.1 pTIE2-GFP在脑内表达相应的蛋白
        2.2 pTIE2-GFP能示踪内皮来源的细胞
+细胞能转化为神经干细胞">        2.3 缺血脑内GFP⁺细胞能转化为神经干细胞
+细胞能表达神经发生相关的转录因子Pax6">        2.4 缺血脑内GFP⁺细胞能表达神经发生相关的转录因子Pax6
+细胞不参与缺血诱导的胶质再生">        2.5 内皮来源的GFP⁺细胞不参与缺血诱导的胶质再生
+细胞能分化为幼稚神经元">        2.6 缺血脑内GFP⁺细胞能分化为幼稚神经元
+细胞能分化为成熟神经元">        2.7 缺血脑内GFP⁺细胞能分化为成熟神经元
+内皮来源细胞具有时间依赖的神经元新生">        2.8 缺血脑内GFP⁺内皮来源细胞具有时间依赖的神经元新生
+细胞参与缺血纹状体内γ-氨基丁酸能和胆碱能神经元再生">        2.9 GFP⁺细胞参与缺血纹状体内γ-氨基丁酸能和胆碱能神经元再生
        2.10 缺血脑内内皮来源的神经元随时间推移逐渐发育成熟
+细胞具有神经元的电生理活性">        2.11 缺血脑内GFP⁺细胞具有神经元的电生理活性
+细胞的转分化">    3. 缺血脑内过表达VEGF促进内皮来源GFP⁺细胞的转分化
        3.1 phVEGF-DsRed和pDsRed在缺血脑内表达相应的蛋白
+细胞数量">        3.2 缺血脑内过表达VEGF增加GFP⁺细胞数量
+细胞参与的神经元新生">        3.3 缺血脑内过表达VEGF促进GFP⁺细胞参与的神经元新生
    4. VEGF对神经元功能的调节作用
        4.1 原代培养的神经元能表达VEGF及其受体
        4.2 海马神经元能合成和释放VEGF
        4.3 VEGF促进原代培养的神经元中突触囊泡蛋白的磷酸化
        4.4 VEGF通过受体作用促进神经元突触囊泡蛋白的磷酸化
（四） 讨论
    1. 缺血损伤脑内的血管重塑与神经元新生的关系
        1.1 缺血损伤诱导的神经元新生
        1.2 缺血脑内的血管重塑
        1.3 缺血脑内的血管增生与神经元新生之间的联系
    2 神经血管单元在缺血损伤修复中的意义
        2.1 神经血管单元与缺血损伤修复的关系
        2.2 神经血管单元重构在缺血诱导的神经元新生过程中的重要性
    3. VEGF对缺血损伤诱导的神经血管单元重构的作用及机制分析
        3.1 VEGF对缺血损伤诱导的神经元新生的影响
        3.2 VEGF促进神经元新生机制的探讨
        3.3 VEGF对神经血管单元重构的作用及机制探讨
（五） 小结与结论
    小结
    结论与创新点
（六） 图版说明
（七） 参考文献
综述
    参考文献
附录
    附件一：/?77￡2-GFP质粒大量抽提的酶切鉴定结果
    附件二 ：致谢
    附录三：研究生期间发表及完成论文



本文编号：2958194