抑制SMN2外显子7剪接的调控蛋白的鉴定和作用机制研究

发布时间：2021-01-08 06:39

　　脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种高发病率并导致婴儿致死的常染色体隐形神经肌肉障碍疾病。导致这种疾病的遗传学原因是纯和的丢失SMN1基因。但其同源的SMN2有外显子7上6位的C到T的突变导致其不剪接，产生截短的且不稳定的SMN蛋白，不能补偿全长的SMN蛋白的功能。所以说，增加SMN2外显子7的剪接目前被认为是可行、有效的方法来治疗脊髓性肌萎缩症。因此，SMN2外显子7的可变剪接调控的研究变得尤为重要。本论文通过初步的RNA干扰鉴定出了新的SMN2外显子7剪接的抑制因子-hnRNP U，同时还发现了hnRNP U的一项新功能-可变剪接调控因子，因为目前没有报道发现hnRNP U参与调控可变剪接。同时还发现它既调控SMN2外显子7剪接，也调控SMN1外显子7剪接，并不响应SMN2外显子7上C到T的突变位点。深入研究后发现重组的hnRNP U在体外并不结合SMN2外显子7和它附近的内含子RNA，但是在体内结合SMN2pre-mRNA。它的作用方式即不依赖于已知的内含子剪接抑制元件，也与该基因的转录速率无关。这暗示hnRNP U可能通过以前未被发现的... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1. 可变剪接调控的介绍
        1.1 前体 RNA 可变剪接
        1.2 剪接位点的识别和选择
        1.3 帮助剪接位点识别
        1.4 抑制剪接位点识别
        1.5 位置依赖性的剪接调控
        1.6 RNA 结构在可变剪接调控中的作用
        1.7 蛋白因子调控可变剪接
        1.8 转录偶联的可变剪接调控
        1.9 可变剪接和组织特异性
        1.10 组成型剪接调控因子调控可变剪接
        1.11 可变剪接与人类疾病
        1.12 展望
    2. SMA 和 SMN 的介绍
        2.1 SMA 疾病的介绍
        2.2 SMA 疾病相关的 SMN2 外显子 7 可变剪接的机制
        2.3 SMA 的治疗方面的进展
    3. hnRNP U 的介绍
    4. 本课题的研究内容及意义
        4.1 课题研究的内容
        4.2 课题的研究意义
第二章 材料和方法
    1. 材料
        1.1 菌株、质粒及细胞系
        1.2 生化药品及来源
        1.3 细胞培养及操作相关的试剂
        1.4 酶类和 DNA marker，蛋白 marker
        1.5 抗体及其相关
        1.6 ssRNA 和 siRNA 合成
        1.7 本研究所用引物
        1.8 分析软件和网络资源
        1.9 图像编辑软件
        1.10 仪器
    2. 溶液的配制
        2.1 细菌用抗生素的配制
        2.2 蛋白纯化中所用的缓冲液
        2.3 DMEM 细胞培养基的配制
        2.4 细胞专用 PBS 的制备
        2.5 细胞专用胰酶的配制
        2.6 免疫沉淀及免疫印迹相关溶液的配方
    3. 方法
        3.1 E. coli RNase III 的制备和纯化
        3.2 人类 RNA 结合蛋白 esiRNA 库的制备
        3.3 细胞培养和转染
        3.4 免疫印迹
        3.5 RT-PCR
        3.6 Trizol 中提取蛋白
        3.7 突变克隆
        3.8 克隆的构建
        3.9 免疫共沉淀
        3.10 RIP-PCR
        3.11 免疫共定位
        3.12 CLIP-seq 实验流程及注意事项
        3.13 RNA-seq
第三章 结果与讨论
    1. RNAi 筛选发现 HnRNP U 是一个新的抑制 SMN2 可变外显子 7 剪接的剪接调控因子。
    2.hnRNP U 沉默同样会增强 SMN1 的剪接，暗示 hnRNP U 不是通过靶向外显子 7 的 C 到 T 变化所产生的 ESS 而起作用的
    3. hnRNP U 抑制 SMN2 的剪接不依赖于任何已知的 ISS
    4. hnRNP U 可能不是通过影响转录延伸来抑制 SMN 外显子７的剪接的
    5. hnRNP U 在体外不与 SMN2 外显子 7 及附近的内含子 RNA 结合，而在细胞内结合 SMN2 转录本
    6. 大规模筛选人类 RNA 结合蛋白发现了另外 8 个新的抑制 SMN2 外显子 7 剪接的蛋 白质，其中 5 个是与 U2 snRNP 相互作用的蛋白
    7. hnRNP U 与 U2AF65/35 通过 RNA 依赖的方式相互结合，并协同调控 SMN2 外显 子 7 的剪接
    8. CLIP 鉴定 hnRNP U 结合的 RNA 靶标
    9. hnRNP U 结合 U2 snRNA，证明它是 U2 snRNP 的一个重要组分
第四章 研究工作总结和展望
参考文献
研究生期间发表或待发表论文
致谢
缩写索引



本文编号：2964117