EA-IL-15溶瘤腺病毒的构建及其对胶质瘤细胞特异性及有效性研究

发布时间：2021-01-12 19:09

　　目的构建插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒（oAD-EA-IL-15）,探讨其在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果和特异性。方法 PCR法将EA-IL-15双基因插入腺病毒穿梭载体pXC1,将穿梭质粒pXC1-EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1,3 Cre质粒共转染HEK393细胞,获得溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。通过CCK-8细胞毒性实验,测定细胞相对活性,绘制剂量反应曲线。结果成功构建溶瘤腺病毒载体（oAD）及含EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒载体（oAD-EA-IL-15）;体外包装获得相应的溶瘤腺病毒oAD和oAD-EA-IL-15;oAD对小鼠胶质瘤细胞GL261有明显杀伤作用（P<0.05）,对小胶质细胞BV2（非肿瘤细胞）的杀伤作用明显低于对GL261（P<0.05）,说明oAD具有特异性;oAD-EA-IL-15和oAD分别感染GL261、BV2细胞,对于GL261,oAD-EA-IL-15的半抑制浓度(IC₅₀)值为0.58×10⁷±1.30×10⁵ PFU/ml较oAD... 

【文章来源】：医学研究杂志. 2020,49(10)

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【部分图文】：

图6 双基因溶瘤腺病毒特异性分析

2.溶瘤腺病毒oAD对胶质瘤细胞的体外杀伤作用及特异性研究:溶瘤腺病毒oAD感染胶质瘤细胞GL261,72h后倒置显微镜下观察,可见对照组细胞贴壁生长,排列规则,细胞密度大。实验组中随着MOI值的增高,细胞密度减少,细胞形态皱缩,详见图1。说明oAD对GL261细胞有一定的杀伤作用。将oAD同时作用于GL261细胞及小胶质细胞BV2(非肿瘤细胞)。感染72h后测定细胞相对活性,可以看到与对照组(PBS)比较,oAD对GL261具有明显的杀伤作用(P<0.05),并且在不同MOI值病毒的作用下,oAD对GL261的杀伤作用明显高于对BV2,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),详见图2。图2 空载溶瘤腺病毒(oAD)特异性及有效性分析

图1 倒置显微镜下观察空载溶瘤腺病毒(oAD)对胶质瘤细胞GL261形态的影响(×100)3.构建插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15):为了增强溶瘤病毒对胶质瘤细胞的杀伤作用,笔者将Endo-Angio及IL-15基因定向克隆构建到溶瘤腺病毒oAD的腺病毒穿梭载体pXC1中,构建成EA-IL-15双基因腺病毒载体pXC1-EA-IL-15。PCR的方法检测所插入的基因,可见挑取的8个克隆株中有7个携带有EA-IL-15基因,详见图3。Endo-Angio基因和IL-15基因中间通过核糖体进入位点(IRES)连接,可同时表达,详见图4。笔者进一步将穿梭质粒pXC1- EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1, 3Cre质粒共转染HEK393细胞,得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。


本文编号：2973377