诱导超氧化物歧化酶错误折叠的因素及其分子机制

发布时间：2021-01-15 17:44

　　1.肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyorophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病,研究表明一部分原因是由于SOD1的突变产生了聚集。SOD1作为Cu2+结合蛋白在神经细胞内浓度很高,同时由于Cu具有强氧化性,因此我们将研究是否不正常的Cu2+浓度能解释SOD1突变体导致的ALS疾病。我们研究了Cu2+在诱导病理型突变体A4V和氧化的WT SOD1产生聚集方面的作用。研究首次表明Cu2+对A4V的氧化修饰主要发生在第111位半胱氨酸上。A4V与Cu2+的结合主要有两个位点：一个中等亲和力的结合位点（186nM）和一个较高亲和力的结合位点（1.83nM）。高浓度的Cu2+不仅可以诱导A4V的氧化修饰,同时也引发A4V蛋白的快速聚集。研究发现Cu2+与氧化型WT SOD1的结合和引发氧化型WT蛋白的聚集方面与Cu2+和A4V的方式基本相似。所以我们表明不正常的Cu2+作用解释了SOD1突变体诱发家族性ALS和偶发性ALS疾病方面具有重要作用。2.由SOD1（human copper, zinc superoxide dismutase）,即铜锌超氧化... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 神经退行性疾病
        1.1.1 神经退行性疾病种类
        1.1.2 神经退行性疾病的病理机制
    1.2 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）
        1.2.1 家族性ALS（fALS）
        1.2.2 偶发性ALS（sALS）
    1.3 SOD1和ALS
        1.3.1 SOD1
            1.3.1.1 SOD1结构,折叠和稳定性
            1.3.1.2 SOD1纤维化：二硫键和金属离子共同作用的结果
        1.3.2 SOD1—ALS致病原因
            1.3.2.1 铜锌超氧化物歧化酶的氧化修饰
            1.3.2.2 SOD1突变体与Cu的亲和力增加
            1.3.2.3 SOD1半胱氨酸氧化作用导致蛋白出现单体化
            1.3.2.4 半胱氨酸氧化修饰的SOD1形成氧化压力
        1.3.3 野生型SOD1在ALS疾病中的作用
    1.4 展望
    1.5 研究方法
        1.5.1 荧光光谱
        1.5.2 90°光散射
        1.5.3 透射电镜（TEM）
        1.5.4 等温滴定量热技术
    1.6 课题的研究意义
        1.6.1 铜对SOD1的氧化修饰及对SOD1聚集的影响
        1.6.2 WT SOD1在ALS疾病中的作用
第二章 铜离子介导SOD1的氧化修饰,引发SOD1的聚集
    摘要
    引言
    2.1 实验材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 试剂——缓冲液
        2.1.3 实验方法
            2.1.3.1 质粒（PET3d）
            2.1.3.2 野生型human-SOD1的表达、提取与纯化
            2.1.3.3 Human-SODl突变体（C111S）的表达与纯化
            2.1.3.4 突变体A4V-SOD1的表达、提取与纯化
            2.1.3.5 铜锌超氧化物歧化酶脱辅基的过程
            2.1.3.6 检测蛋白的聚集
            2.1.3.7 原子力显微镜检测聚集体
            2.1.3.8 Nano-LC-MS/MS的检测
            2.1.3.9 高效液相色谱（HPLC）
            2.1.3.10 等温滴定量热（ITC）
    2.2 实验结果
2+作用下,SOD1突变体A4V比野生型SOD1聚集的更快,更严重">        2.2.1 在较高的Cu²⁺作用下,SOD1突变体A4V比野生型SOD1聚集的更快,更严重
2+作用下,SOD1突变体A4V聚集体的形态">        2.2.2 原子力显微镜检测在较高的Cu²⁺作用下,SOD1突变体A4V聚集体的形态
2H,磺酸化C-SO₃">        2.2.3 A4V在高Cu条件出现111位半胱氨酸的氧化修饰(亚磺酸化C-SO₂H,磺酸化C-SO3

        2.2.4 较高的Cu离子不仅能够诱导氧化修饰的A4V聚集,也会带动非氧化的A4V现聚集
        2.2.5 较高的Cu离子诱导氧化的野生型SOD1聚集
        2.2.6 A4V和氧化的野WT SOD1与Cu具有相似的结合模式
    2.3 本章讨论
第三章 野生型超氧化物歧化酶在超氧化物歧化酶突变体聚集过程中的重要作用
    摘要
    前言
    3.1 实验材料和方法
        3.1.1 材料和试剂
        3.1.2 实验缓冲液
        3.1.3 Human-SOD1几种突变体（C111S、A4V、G93A、S134N）的表达与纯化
            3.1.3.1 生理条件下蛋白产生聚集
            3.1.3.2 ThT荧光法检测SOD1聚集体的产生
            3.1.3.3 紫外浊度检测
            3.1.3.4 电镜检测聚集体的形态
            3.1.3.5 ANS外源荧光检测蛋白疏水区暴露
            3.1.3.6 Edman测序
            3.1.3.7 实验数据结果分析
    3.2 实验结果
        3.2.1 在三氟乙酸（TFE）条件下,突变体A4V/S134N带动野生型SOD1产生聚集
        3.2.2 在生理条件下,突变体A4V带动WT SOD1产生聚集
        3.2.3 检测SOD1s在不同条件下产生的聚集体的形态
        3.2.4 混合体系产生的聚集体内存在WT SOD1
        3.2.5 游离半胱氨酸（第6和111位）在蛋白聚集中起了重要作用
    3.3 本章讨论
2O₂诱导WT SOD1产生纤维样聚集">第四章 H₂O₂诱导WT SOD1产生纤维样聚集
    摘要
    引言
    4.1 实验材料与方法
        4.1.1 材料见第二章
        4.1.2 实验方法
            4.1.2.1 野生型human-SOD1的表达、提取与纯化（见第二章）
            4.1.2.2 检测蛋白的聚集
            4.1.2.3 原子力显微镜检测聚集体
            4.1.2.4 透射电镜检测聚集体
            4.1.2.5 Nano-LC-MS/MS的检测
            4.1.2.6 CPD荧光探针检测半胱氨酸的次磺酸化反应
    4.2 实验结果
2O₂,WT SOD1产生纤维样的聚集体">        4.2.1 病理浓度的H₂O₂,WT SOD1产生纤维样的聚集体
2O₂条件下也会出现氧化修饰（-SO₂H）">        4.2.2 111位半胱氨酸在较低的H₂O₂条件下也会出现氧化修饰（-SO₂H）
2O₂诱导WT SOD1产生聚集的过程中111位半胱氨酸具有重要作用">        4.2.3 较低的H₂O₂诱导WT SOD1产生聚集的过程中111位半胱氨酸具有重要作用
        4.2.4 111位半胱氨酸形成分子间的二硫键起始WT SOD1的聚集
    4.3 本章讨论
参考文献
攻读博士学位期间待发表的论文目录
致谢



本文编号：2979241

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