Sestrin2过表达在SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/恢复模型中对线粒体分裂的调控研究
发布时间：2021-03-22 05:33
目的构建Sestrin2（SESN2）基因过表达稳转SH-SY5Y细胞株,并建立OGD/R模型模拟脑缺血再灌注损伤,探讨应激诱导蛋白SESN2过表达对线粒体分裂的调控作用及其机制。方法慢病毒转染构建SESN2过表达及空载体稳转细胞株;利用SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/恢复模型（OGD4h/R18h）模拟脑缺血再灌注损伤,实验分为两部分,第一部分探究SESN2过表达对SH-SY5Y细胞OGD/R模型中细胞活性、线粒体分裂的调控以及SESN2过表达对Keap1/Nrf2通路的激活作用,分为正常对照组、氧糖剥夺/恢复组、空载体组、SESN2过表达组,各组细胞进行OGD4h/R18h,采用CCK-8检测细胞存活率,采用Western blot检测SESN2、Drp1、Fis1、Bcl-2、Bax、胞浆Keap1、胞核Nrf2的蛋白表达,采用透射电镜观察线粒体的超微结构;采用免疫荧光检测Nrf2的核移位;第二部分探究Keap1/Nrf2通路是否参与SESN2对线粒体分裂的调控,分为SESN2过表达组、通路抑制剂Brusatol+SESN2过表达组（Brusatol终浓度为100nM预处理4h）、D...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：41 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
各组细胞SESN2、Bcl-2、Bax蛋白表达的比较（***P<0.001，*P<0.05，NS:P>0.05）
青岛大学硕士学位论文102.SESN2过表达在OGD/R中对线粒体分裂的影响Westernblot分析结果显示，与对照组相比，OGD/R组和Vector+OGD/R组Drp1、Fis1蛋白水平明显升高（P<0.001）；与OGD/R组相比，OE-SESN2+OGD/R组Drp1、蛋白水平明显降低（P<0.001），Fis1蛋白水平明显降低（P<0.001），见表2、图2A；电镜观察线粒体超微结构，Control组可见清晰的线粒体双层膜结构、线粒体嵴，而OGD/R组与Vector+OGD/R组可见线粒体肿胀，甚至空泡样变，线粒体基质颗粒消失、嵴结构破坏。OE-SESN2+OGD/R组线粒体较完整，可见清晰的基质颗粒、线粒体嵴，结构基本正常，见图2B。结果表明SESN2过表达能在氧糖剥夺/复糖复氧损伤中可下调Drp1、Fis1从而抑制线粒体分裂，保护线粒体结构的完整性。图2A各组细胞Drp1、Fis1蛋白表达的比较（***P<0.001,NS:P>0.05）
结果11图2B电镜下各组细胞线粒体形态的比较（黑色箭头：线粒体结构完整，嵴结构清晰，白色箭头：肿胀、空泡化的线粒体）3.SESN2过表达对Keap1/Nrf2通路的影响Westernblot分析结果显示，与对照组相比，OGD/R组和Vector+OGD/R组胞浆Keap1蛋白水平明显下降（P<0.001），胞核Nrf2蛋白水平升高（P<0.05），OGD/R组与Vector+OGD/R组相比，实验结果无统计学差异（P>0.05）；与OGD/R组相比，OE-SESN2+OGD/R组胞浆Keap1蛋白水平明显降低（P<0.05），胞核Nrf2蛋白水平明显增加（P<0.001）见表2、图3A，实验结果表明氧糖剥夺/复糖复氧可使得Keap1下调而促进Nrf2核转位，Keap1/Nrf2通路一定程度上被激活；此外SESN2过表达明显下调Keap1蛋白水平、促进通路的激活；免疫荧光结果显示，Control组Nrf2红色荧光分布在胞浆，OGD/R组与Vector+OGD/R组除了胞浆，部分胞核内也能观察到Nrf2红色荧光，而OE-SESN2+OGD/R组Nrf2红色荧光除了胞浆，在胞核观察到明显聚集，见图3B。结果进一步表明SESN2过表达促进Nrf2核转位，明显激活Keap1/Nrf2通路。
本文编号：3093788
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：41 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
各组细胞SESN2、Bcl-2、Bax蛋白表达的比较（***P<0.001，*P<0.05，NS:P>0.05）
青岛大学硕士学位论文102.SESN2过表达在OGD/R中对线粒体分裂的影响Westernblot分析结果显示，与对照组相比，OGD/R组和Vector+OGD/R组Drp1、Fis1蛋白水平明显升高（P<0.001）；与OGD/R组相比，OE-SESN2+OGD/R组Drp1、蛋白水平明显降低（P<0.001），Fis1蛋白水平明显降低（P<0.001），见表2、图2A；电镜观察线粒体超微结构，Control组可见清晰的线粒体双层膜结构、线粒体嵴，而OGD/R组与Vector+OGD/R组可见线粒体肿胀，甚至空泡样变，线粒体基质颗粒消失、嵴结构破坏。OE-SESN2+OGD/R组线粒体较完整，可见清晰的基质颗粒、线粒体嵴，结构基本正常，见图2B。结果表明SESN2过表达能在氧糖剥夺/复糖复氧损伤中可下调Drp1、Fis1从而抑制线粒体分裂，保护线粒体结构的完整性。图2A各组细胞Drp1、Fis1蛋白表达的比较（***P<0.001,NS:P>0.05）
结果11图2B电镜下各组细胞线粒体形态的比较（黑色箭头：线粒体结构完整，嵴结构清晰，白色箭头：肿胀、空泡化的线粒体）3.SESN2过表达对Keap1/Nrf2通路的影响Westernblot分析结果显示，与对照组相比，OGD/R组和Vector+OGD/R组胞浆Keap1蛋白水平明显下降（P<0.001），胞核Nrf2蛋白水平升高（P<0.05），OGD/R组与Vector+OGD/R组相比，实验结果无统计学差异（P>0.05）；与OGD/R组相比，OE-SESN2+OGD/R组胞浆Keap1蛋白水平明显降低（P<0.05），胞核Nrf2蛋白水平明显增加（P<0.001）见表2、图3A，实验结果表明氧糖剥夺/复糖复氧可使得Keap1下调而促进Nrf2核转位，Keap1/Nrf2通路一定程度上被激活；此外SESN2过表达明显下调Keap1蛋白水平、促进通路的激活；免疫荧光结果显示，Control组Nrf2红色荧光分布在胞浆，OGD/R组与Vector+OGD/R组除了胞浆，部分胞核内也能观察到Nrf2红色荧光，而OE-SESN2+OGD/R组Nrf2红色荧光除了胞浆，在胞核观察到明显聚集，见图3B。结果进一步表明SESN2过表达促进Nrf2核转位，明显激活Keap1/Nrf2通路。
本文编号：3093788
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