脑微血管内皮细胞来源的外泌体在致脑膜炎大肠杆菌感染中的作用研究

发布时间：2021-04-21 12:34

　　细菌性脑膜炎是一种重要的致死性传染性疾病,致脑膜炎大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是其主要病原,破坏血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是E.coli引起脑膜炎的关键步骤。BBB能够通过控制相关物质的进出使中枢神经系统（central nervous system,CNS）免受血液中的毒素和病原体的侵害。BBB主要由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）、星形胶质细胞和周细胞组成,细胞间的物质交换与信息交流对维持BBB结构与功能的完整性至关重要。外泌体是一种由细胞二次胞吞形成的微小囊泡,通过携带蛋白质、核酸和脂质等物质在细胞间的信息传递中发挥着重要作用。E.coli通过与BMECs相互作用能够引起BBB结构完整性的丧失和功能的改变,BMECs来源的外泌体在这一过程中发挥的作用尚不清楚。为此,本研究采用致脑膜炎大肠杆菌PCN033感染BMECs细胞,并对该细胞来源的外泌体进行分离鉴定。在此基础上,对感染前后BMECs来源的外泌体的功能进行了探究,并对外泌体中的miRNA进行... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表（Abbreviation）
1 前言
    1.1 大肠杆菌
        1.1.1 大肠杆菌的分类
        1.1.2 ExPEC脑膜炎
    1.2 血脑屏障
        1.2.1 脑微血管内皮细胞
        1.2.2 星形胶质细胞
    1.3 外泌体
        1.3.1 外泌体的生成与运输
        1.3.2 外泌体的成分
    1.4 miRNA
        1.4.1 miRNA的作用
        1.4.2 miRNA与外泌体
    1.5 本研究的目的和意义
2 材料及方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 细胞系
        2.1.3 药品试剂
        2.1.4 仪器设备
        2.1.5 各种试剂配制方法
        2.1.6 引物
    2.2 试验方法
        2.2.1 BMECs和U251的传代培养
        2.2.2 BMECs的饥饿处理
        2.2.3 细菌刺激细胞和收集样品
        2.2.4 外泌体的提取
        2.2.5 外泌体的提纯
        2.2.6 外泌体的提纯后洗脱液的置换
        2.2.7 外泌体透射电镜观察
        2.2.8 外泌体粒径分析
        2.2.9 细胞RNA提取和浓度测定
        2.2.10 外泌体RNA提取和浓度测定
        2.2.11 BCA法测定外泌体/细胞蛋白浓度
        2.2.12 外泌体/细胞总蛋白样品的制备
        2.2.13 SDS-PAGE凝胶电泳
        2.2.14 Western Blotting
        2.2.15 荧光定量q PCR
        2.2.16 外泌体摄取实验
        2.2.17 ECIS测定外泌体对BMECs细胞屏障功能的影响
        2.2.18 外泌体miRNA建库和测序分析
        2.2.19 外泌体miRNA KEGG富集分析
        2.2.20 统计分析
3 结果与分析
    3.1 外泌体的分离和鉴定
    3.2 外泌体作用于BMECs
        3.2.1 外泌体能被BMECs细胞摄取
        3.2.2 PCN033感染BMECs细胞分泌的外泌体能破坏BMECs的屏障功能
        3.2.3 PCN033感染的BMECs分泌的外泌体促进BMECs活化
    3.3 外泌体作用于星形胶质细胞U251
        3.3.1 外泌体能被U251摄取
        3.3.2 PCN033感染BMECs细胞分泌的外泌体抑制U251活化
    3.4 外泌体miRNA测序分析
        3.4.1 miRNA维恩图分析
        3.4.2 miRNA差异表达分析
        3.4.3 miRNA聚类分析
        3.4.4 差异表达miRNA靶基因KEGG分析
    3.5 外泌体miRNA测序结果验证和分析
        3.5.1 外泌体miRNA测序结果验证
        3.5.2 外泌体差异表达miRNA的靶基因预测与KEGG分析
4 讨论
    4.1 Ex PEC感染BMECs细胞分泌的外泌体促进BMECs上调表达ICAM-1484.2 Ex PEC感染BMECs细胞分泌的外泌体抑制U251表达GFAP
    4.2 ExPEC 感染 BMECs 细胞分泌的外泌体抑制 U251 表达GFAP
    4.3 Ex PEC感染BMECs细胞分泌的外泌体中差异表达miRNA的分析
5 结论
参考文献
致谢



本文编号：3151766