人成纤维细胞转分化形成神经元前体细胞的研究

发布时间：2021-04-21 18:16

　　神经退行性疾病（Neurodegenerative disease）是大脑或脊髓的神经细胞的结构和功能丧失导致的神经疾病,如：阿兹海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症和脊髓侧索硬化症等,对人类特别是老年人的健康构成了巨大的威胁。人们试图通过化学药物治疗这些疾病,但都没有取得好的效果。于是,人们尝试通过细胞移植治疗的方法修复受损神经元。到目前为止,已经有多种细胞通过移植实验被证明对神经修复具一定作用,如多能性干细胞（PSCs）、造血干细胞（HSCs）、间充质干细胞（MSCs）、神经干细胞（NSCs）、限制性神经元前体细胞（NRPs）、特定的神经元（special neurons）等。由于多能性干细胞具有自我更新和分化为各种细胞类型的能力,然而这类细胞分化方向难以控制,直接注射到体内易形成畸胎瘤,所以并不适合直接用于临床治疗。造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞是成体中存在的,并且研究得最深入的三类成体干细胞。造血干细胞和间充质干细胞在一定条件下可表达神经细胞相关基因,因此临床前研究常使用这两类干细胞进行神经退行性疾病的治疗。然而,这两类干细胞在体内转分化成为神经细胞的效率非常低,对神经系统疾病... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 体细胞重编程与转分化研究进展
        1.2.1 体细胞重编程
            1.2.1.1 克隆技术
            1.2.1.2 细胞融合重编程
            1.2.1.3 iPS技术及转录因子
            1.2.1.4 转分化研究
    1.3 神经系统发育
        1.3.1 神经系统发育简介
        1.3.2 神经细胞的发育
            1.3.2.1 神经干细胞与神经前体细胞
            1.3.2.2 神经元前体细胞
            1.3.2.3 神经元
            1.3.2.4 胶质细胞
    1.4 神经退行性疾病及细胞治疗
        1.4.1 神经退行性疾病
        1.4.2 神经退行性疾病的治疗方法
            1.4.2.1 非细胞治疗方法
            1.4.2.2 细胞治疗方法
    1.5 神经细胞的分化与转化分化研究
        1.5.1 神经细胞的分化与转分化概述
        1.5.2 ES/iPSC诱导为神经干细胞或神经元
        1.5.3 转分化获得神经干细胞或神经前体细胞
        1.5.4 转分化获得功能性神经元
    1.6 本课题选题依据及研究内容
第二章 实验材料与试剂
    2.1 实验动物
    2.2 实验耗材
    2.3 实验仪器
    2.4 实验试剂和试剂盒
        2.4.1 分子实验用试剂
        2.4.2 细胞培养用试剂
        2.4.3 分子实验用溶液配制
        2.4.4 细胞培养液配制
        2.4.5 免疫荧光用溶液配制
        2.4.6 电生理用溶液配制
第三章 实验方法与步骤
    3.1 细胞培养
        3.1.1 293T细胞培养
        3.1.2 K562细胞培养
        3.1.3 U251细胞培养
        3.1.4 hiPS细胞培养
            3.1.4.1 饲养层细胞的制备
            3.1.4.2 人诱导多潜能性干细胞（hiPS）细胞培养
        3.1.5 hiPS细胞诱导神经前体细胞
        3.1.6 人胎儿皮肤成纤维细胞分离培养
    3.2 慢病毒包装
        3.2.1 筛选候选基因
            3.2.1.1 引物设计合成
            3.2.1.2 RNA提取
            3.2.1.3 反转录PCR（RT-PCR）
            3.2.1.4 PCR反应
            3.2.1.5 电泳观察
        3.2.2 慢病毒载体构建
            3.2.2.1 双酶切
            3.2.2.2 回收载体及基因片段
            3.2.2.3 目的DNA片段的连接
            3.2.2.4 连接产物转化
            3.2.2.5 重组质粒小量提取
            3.2.2.6 重组质粒的鉴定
            3.2.2.7 质粒中提和保存
        3.2.3 慢病毒包装和收集
            3.2.3.1 慢病毒包装
            3.2.3.2 慢病毒收集
            3.2.3.3 病毒滴度测试
    3.3 神经元前体细胞（hiNRPs）的诱导过程
        3.3.1 八因子诱导过程
        3.3.2 减少外源因子
        3.3.3 优化诱导培养条件
    3.4 神经元前体细胞（hiNRPs）的鉴定
        3.4.1 反转录PCR鉴定
        3.4.2 实时定量PCR鉴定
        3.4.3 Nestin甲基化分析
            3.4.3.1 细胞基因组DNA提取
            3.4.3.2 硫酸氢盐对DNA进行修饰
            3.4.3.3 PCR扩增及连接
            3.4.3.4 测序结果分析
        3.4.4 核型分析
        3.4.5 细胞免疫荧光检测
        3.4.6 全基因组表达分析
    3.5 神经元前体细胞（hiNRPs）的体外分化和鉴定
        3.5.1 诱导神经元前体细胞（hiNRPs）的体外分化实验
            3.5.1.1 诱导神经元
            3.5.1.2 诱导星形胶质细胞
            3.5.1.3 诱导少突胶质细胞
        3.5.2 分化细胞的免疫荧光检测
        3.5.3 hiNRP细胞分化的神经元电生理检测
    3.6 神经元前体细胞（hiNRPs）的移植和鉴定
        3.6.1 神经元前体细胞体内移植实验
        3.6.2 Morris水迷宫实验
        3.6.3 脑组织切片
        3.6.4 组织免疫荧光检测
第四章 实验结果
    4.1 分离获得人胚胎成纤维细胞和诱导获得人神经前体细胞
    4.2 载体构建
    4.3 直接诱导获得人神经元前体细胞
    4.4 减少外源因子诱导神经元前体细胞
    4.5 优化神经元前体细胞的诱导培养条件
    4.6 诱导神经元前体细胞（hiNRPs）的检测
        4.6.1 hiNRPs的形态特点
        4.6.2 RT-PCR和q-PCR检测hiNRPs的基因表达
        4.6.3 免疫荧光法检测hiNRPs的基因表达
        4.6.4 hiNRP细胞核型和成瘤实验检测
        4.6.5 Nestin增强子的甲基化检测
    4.7 全基因组表达分析
    4.8 hiNRPs的体外分化检测
    4.9 电生理检测
    4.10 体内分化检测
第五章 讨论
第六章 结论
参考文献
附录
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果



本文编号：3152244