小分子化合物在杜兴肌肉萎缩症治疗中的应用研究

发布时间：2021-06-25 11:03

　　杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一种致死性的X染色体连锁隐性遗传神经肌肉失调症,由于DMD基因突变,导致功能性dystrophin蛋白缺失所致,目前临床上缺乏有效的治疗手段。其临床表征主要为全身肌肉进行性退化萎缩,最终致死。在本研究中,拟对临床常用的食品级小分子化合物进行筛选和鉴定,通过在DMD小鼠（mdx）模型上的局部和系统测试,以期发现能够改善mdx小鼠肌肉病理、炎症和促进肌肉再生及分化的小分子化合物,为DMD辅助治疗提供新的候选药物。首先利用体外肌肉细胞模型,通过细胞计数法检测细胞增殖速度,以筛选能够增强细胞增殖的候选小分子化合物。在mdx小鼠模型上,对候选小分子化合物进行局部和系统筛选测试,通过免疫荧光、胶原和炎症病理染色等方法,以确认候选化合物对肌肉再生和病理的改善作用。为检测不同给药途径,对候选化合物作用效果的影响,拟测试饲喂和尾静脉注射两种途径,通过免疫荧光染色、H&E染色等方法,以确认不同给药方式对候选小分子化合物作用效果的影响。为测试候选化合物长期的作用效果,拟对mdx小鼠进行为期3月的系统治疗,通过抓力测试、... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

Dystrophin蛋白结构示例图

结果2.1 小分子化合物在杜兴肌肉萎缩症上的筛选和鉴定2.1.1 小分子化合物的体外筛选前期报道不同的营养物质如支链氨基酸，精氨酸等应用于 DMD 病人的临辅助治疗，但其效果有限[6]-[11]。为了筛选更有效的小分子化合物，我们利用鼠 C2C12 成肌细胞模型，通过筛选能够促进肌肉细胞增殖的小分子化合物，期发现改善 DMD 临床病症的小分子化合物。通过细胞计数来检测细胞增殖况，我们发现在 G1、G2、G3、G4、G5、G6 和 G7 这几类小分子化合物中，GG2、G3 和 G5 对细胞增殖作用最为明显，其中 G1 效果最强，经 24h 处理后使细胞数目由 8000 个增殖到 25000 个，相对于 10% FBS 正常培养基处理组，有显著性差异，结果见图 2A，B。进一步选用 cck8 试剂盒进行细胞增殖活性测，结果表明 G1、G3 和 G5 相对于正常培养组，其细胞活性的 ratio 比能达1.7（图 2C），综上说明，G1、G2、G3 和 G5 是促进肌肉细胞增殖的候选化合物

天津医科大学硕士学位论文 结果处理后的细胞个数统计（*P < 0.05, n=3）。（C）CCK8 试剂盒检测的细胞活性统计（*P< 0.05, n=3）。2.1.2 候选小分子化合物在 mdx 小鼠上的局部筛选体外测试结果显示：G1、G2、G3 和 G5 对肌肉细胞表现为更强的促进增殖效果，为验证这些候选小分子化合物在体内的作用效果，本研究将在 mdx 小鼠上进行局部筛选。分别将 G1、G2、G3 和 G5 在 mdx 小鼠前肌骨肌肉上测试，使用浓度均为 5%，以生理盐水在前胫骨肌肉上测试为对照，单次注射，注射 3天后收样，检测小鼠肌肉的新生情况。利用 IHC 检测新生肌纤维标记蛋白（eMyHC）阳性肌纤维的分布和表达情况，结果显示：在这四种处理组中，相对于生理盐水对照组，G1 处理组 eMyHC 阳性肌纤维分布更为均一，数量更多，能达到 300 个，其次为 G3，eMyHC 阳性肌纤维数能达到 200 个，说明 G1 诱导新生肌纤维产生的效果较佳（图 3）。


本文编号：3249094