MassARRAY质谱分析脑胶质瘤6个基因11个突变位点的方法建立与应用

发布时间：2021-07-01 09:37

　　目的:基于MassARRAY质谱分析技术建立脑胶质瘤6个基因11个位点的突变检测方法。方法:通过文献检索并结合对脑胶质瘤分子病理的研究进展,确定了与临床分级、诊断、及预后密切相关的6个靶基因,对目的基因进行突变位点筛选并确定热点突变。按MassARRAY突变位点标示方法和引物设计固定格式,将基因突变位点进行标注,并利用Agena BioScience在线软件,设计突变位点的正、反向扩增引物和延伸引物。收集40例脑胶质瘤患者的石蜡样本建立检测方法,并采用聚合酶链式反应（PCR）联合一代测序方法进行结果验证。结果:筛选出8对扩增引物和11条延伸引物,通过2组多重PCR扩增延伸及质谱解吸电离技术实现11个位点的基因分型检测。与一代测序法相比灵敏度为100%,特异度为97%。结论:成功建立MassARRAY质谱分析脑胶质瘤6个基因11个位点突变检测方法,与一代测序相比质谱分析法更经济和更节约时间。 

【文章来源】：分析仪器. 2020,(06)

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

前5个基因突变位点的质谱图型

后6个基因突变位点质谱图型

一代测序技术是荧光标记测序法，仪器通过检测ddNTP上的荧光来读取所测序列，荧光染料会干扰测序引物相邻的几十个碱基信号，导致无法读出序列，加之引物本身不含荧光，都是没信号的部分，这也要求设计引物时引物序列需距检测的目标位点最少60bp以上；且测序前需纯化回收PCR片段，为了保证回收效率，扩增的PCR片段长度不易低于200bp。与MassArray技术不同，引物前无需加标签序列，其他仍需遵循引物设计原则。两种技术检测结果见表3，突变位点检测一致率为96.4%，有2例样本1号和2号分别在H3.3和IDH1两个指标检测中结果不一致。如图3、图4是1号样本两种方法检测结果，从质谱图上可见H3.3(27）这个位点发生了A/T突变，分子量在5171.3处的T峰面积约为13，分子量5114.4处的A峰面积约为125；而图4一代测序所示无突变。同样图5、图6是2号样本检测结果，图5质谱图上显示IDH1(132）位发生A/G碱基突变，A峰面积约84,G峰面积324，根据峰面积可计算突变比率；图6箭头所示背景峰高，无法判断是否发生突变。表4示40例样本在IDH1和H3.3两个位点检测结果比较，可知MassARRAY灵敏度能达100%，与一代测序检测的真阴性数据相比62/64，特异度约97%。造成这种差异的原因与一代测序技术灵敏度低，大于20%以上的突变才能被检测到有关[12]。测序反应的信号强弱除与模板量有关，还与同一位置不同碱基信号强度不同有关；这会导致即使突变的模板所占的比例较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪软件对扫描结果处理时，一般会将信号弱的峰做为背景信号处理，进一步压低弱的峰，提高主峰，因此对低含量的突变不易检测，高含量突变检测到也不能定量判读。且高GC、重复序列，复杂二级结构的DNA片段对一代测序是个巨大挑战，普通PCR条件很难扩增出单一目的条带，需利用高效热启动酶，梯度PCR程序及多对引物优化才能扩增出目的条带[13,14]，测序时需添加变性剂优化测序信号。质谱方法中因扩增的PCR片段短，可避开一些复杂二级结构；延伸引物只需延伸一个碱基后进行质谱鉴定其分子量。另外MassAR-RAY系统反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，无需各种标记。与芯片技术和质谱技术结合，使得它具备高度特异性、灵敏度和高精确度[15]。能够以快速精确的进行基因型识别，直接测出带有SNP或其他突变的目标DNA[16]。图4 一代测序检测1号样本H3.3-27位点的结果

【参考文献】：
期刊论文
[1]免疫组化和直接测序以及焦磷酸测序对IDH1突变的比较研究[J]. 赵焕英,方霄,李慎涛,甄亚萍,李峰,王雷明.  实验技术与管理. 2019(10)
[2]中国核酸质谱应用专家共识[J]. 陈琛,刘昕超,张海燕.  中华医学杂志. 2018 (12)



本文编号：3258896