R132H型IDH1突变在胶质瘤中作用的初步研究
发布时间：2021-07-08 09:54
第一部分载体的构建、鉴定和稳定转染细胞系的建立目的：构建并鉴定能够在人脑胶质瘤细胞中表达的三种真核表达载体：pcDNA3.1（+）-hIDH1（mu）/3×Flag/IRES/eGFP、 pcDNA3.1（+）-hIDH1（wt）/3×Flag/IRES/eGFP和pcDNA3.1（+）-eGFP。将上述三种载体分别转染人脑胶质瘤U87细胞系，通过G418抗性筛选，以获得三个稳定转染的细胞系U87/mu、U87/wt和U87/vector。其中U87/mu能够表达R132H型突变IDH1，U87/wt能够表达野生型IDH1。方法：设计PCR引物扩增目的基因hIDH1（mu）/3×Flag/IRES/eGFP、hIDH1（wt）/3×Flag/IRES/eGFP和eGFP，分别在上述片段的5’端添加NheⅠ位点，3’端添加XhoⅠ位点后，经双酶切定向克隆入pcDNA3.1（+）骨架；转化大肠杆菌Stbl3后挑取阳性克隆，提取质粒，PCR或双酶切及DNA测序鉴定。将上述鉴定正确的三种载体分别转染人脑胶质瘤U87细胞系，经过G418抗性筛选培养后，倒置荧光显微镜拍照及Western blot...
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
菌落电泳鉴定图
R132H 型 IDH1 突变在胶质瘤中作用的初步研究 第一部分5761 AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC5821 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG5881 GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT5941 CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT6001 TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC6061 ACCTGACGTC说明：将 pcDNA3.1(+)-hIDH1(mu)/3×Flag/IRES/eGFP 序列中用第 1301 位鲜绿色标识的 G 替换为 A 即可得到 pcDNA3.1(+)-hIDH1(mu)/3×Flag/IRES/eGFP 的序列。序列中粉红色字体为 hIDH1(wt)，序列中天蓝色字体为 3×Flag，序列中橙色字体为 IRES，序列中绿色字体 eGFP，序列中黄色字体为 Kozak 序列，序列中蓝色字体为 NheⅠ，序列中红色字体为 XhoⅠ。
28图 1-4：转染试剂（梭华-SofastTM）和质粒 DNA 最佳配比比例6.G418 筛选浓度的确定G418 最佳筛选浓度实验结果如下：U87 细胞在 100~1000μg/ml 的不同浓度梯度筛选培养基中培养 14 天后，300μg/ml 组培养瓶中的细胞全部死亡，而 200μg/ml 组培养瓶中尚有占初始细胞数约 80%的细胞存活。确定最佳 G418 筛选浓度为 300μg/ml。7.转染后三组照片（初步转染、稳定转染）转染试剂（梭华-SofastTM）和质粒 DNA 最佳配比比例实验中，荧光显微镜下，转染试剂与质粒 DNA 按不同配比（4：1、8：1、16：1、32：1）转染 U87 细胞（以转染 pcDNA3.1(+)-eGFP 质粒为例）24h 后在荧光显微镜下拍照显示：4：1 和 8：1组转染效率为 0；16：1 组转染效率约为 5%，32：1 组转染效率约为 15%（图 1-5a）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达[J]. 栗刚,吴秀成,钟声,王巍,李媛,刘丹平. 山东医药. 2011(10)
[2]人BMP2及VEGF双基因共表达腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定[J]. 孙立,田晓滨,张宇坤,郜勇,杨述华. 山东医药. 2006(14)
[3]新一代阳离子聚合物转染试剂（梭华-Sofast）转染效果研究[J]. 杨天赐,陈明桥,黄革玲. 厦门大学学报(自然科学版). 2004(04)
本文编号：3271343
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
菌落电泳鉴定图
R132H 型 IDH1 突变在胶质瘤中作用的初步研究 第一部分5761 AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC5821 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG5881 GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT5941 CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT6001 TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC6061 ACCTGACGTC说明：将 pcDNA3.1(+)-hIDH1(mu)/3×Flag/IRES/eGFP 序列中用第 1301 位鲜绿色标识的 G 替换为 A 即可得到 pcDNA3.1(+)-hIDH1(mu)/3×Flag/IRES/eGFP 的序列。序列中粉红色字体为 hIDH1(wt)，序列中天蓝色字体为 3×Flag，序列中橙色字体为 IRES，序列中绿色字体 eGFP，序列中黄色字体为 Kozak 序列，序列中蓝色字体为 NheⅠ，序列中红色字体为 XhoⅠ。
28图 1-4：转染试剂（梭华-SofastTM）和质粒 DNA 最佳配比比例6.G418 筛选浓度的确定G418 最佳筛选浓度实验结果如下：U87 细胞在 100~1000μg/ml 的不同浓度梯度筛选培养基中培养 14 天后，300μg/ml 组培养瓶中的细胞全部死亡，而 200μg/ml 组培养瓶中尚有占初始细胞数约 80%的细胞存活。确定最佳 G418 筛选浓度为 300μg/ml。7.转染后三组照片（初步转染、稳定转染）转染试剂（梭华-SofastTM）和质粒 DNA 最佳配比比例实验中，荧光显微镜下，转染试剂与质粒 DNA 按不同配比（4：1、8：1、16：1、32：1）转染 U87 细胞（以转染 pcDNA3.1(+)-eGFP 质粒为例）24h 后在荧光显微镜下拍照显示：4：1 和 8：1组转染效率为 0；16：1 组转染效率约为 5%，32：1 组转染效率约为 15%（图 1-5a）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达[J]. 栗刚,吴秀成,钟声,王巍,李媛,刘丹平. 山东医药. 2011(10)
[2]人BMP2及VEGF双基因共表达腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定[J]. 孙立,田晓滨,张宇坤,郜勇,杨述华. 山东医药. 2006(14)
[3]新一代阳离子聚合物转染试剂（梭华-Sofast）转染效果研究[J]. 杨天赐,陈明桥,黄革玲. 厦门大学学报(自然科学版). 2004(04)
本文编号：3271343
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