2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究

发布时间：2021-07-10 09:28

　　目的：杜兴肌肉萎缩症是一种由dystrophin基因突变,导致dystrophin蛋白缺失所引发的致死性神经肌肉失调症,本研究利用杜兴肌肉萎缩症疾病细胞和动物模型来测试一种新的反义寡核苷酸化学结构-2’-O-甲氧乙基（2’-O-MOE）,通过对该反义寡核苷酸化学结构的体外、体内局部和系统的测试,其中包括系统给药剂量和给药途径的优化,预期为杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读的基因治疗方法提供一种候选的反义寡核苷酸药物。与此同时,通过对荧光标记的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物体外和体内试验,来测试该反义寡核苷酸药物在肌肉细胞内的定位和摄取效率及在实验动物各组织内的分布情况。方法：1.浓度效应试验中将300nM、500nM、1μM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE包括MOE20（PS）.MOE25（PS）和MOE25（PO）反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H?K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。2.时间效应试验中将500nM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H2K mdx细胞24h、48h、72h、96h后,利... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
对象和方法
    1 实验材料
        1.1 细胞系
        1.2 实验动物
        1.3 反义寡核苷酸药物
        1.4 常用试剂
        1.5 主要仪器设备
        1.6 引物
        1.7 主要分析工具软件
    2 实验方法
        2.1 试剂配制
        2.2 细胞培养
        2.3 脂质体转染细胞
        2.4 TRIzol法提取细胞总RNA
        2.5 RT-PCR和PCR反应条件
        2.6 组织总蛋白的提取
        2.7 蛋白浓度测定
        2.8 WST-8试剂盒检测反义寡核苷酸毒性
        2.9 免疫荧光组织化学检测
        2.10 Western blot
        2.11 局部肌肉注射
        2.12 系统注射
        2.13 FACS流式细胞仪分析细胞转染效率和荧光强度
        2.14 共聚焦荧光显微镜分析
        2.15 组织中荧光标记MOE25(PS)的定量分析
    3 统计学分析
结果
    1 2'-O-MOE反义寡核苷酸在H_2K mdx细胞的体外测试
        1.1 浓度效应及细胞毒性分析
        1.2 时间效应
        1.3 不同MOE反义寡核苷酸与临床上测试的2'OmePS药物的比较分析
    2 2 '-O-MOE反义寡核苷酸在DMD小鼠模型上的局部和系统测试
        2.1 局部肌肉测试
        2.2 MOE25(PS)反义寡核苷酸在mdx小鼠上的系统测试
    3 MOE25(PS)反义寡核苷酸在体内的组织分布与细胞内的摄取及共定位
        3.1 MOE25(PS)在mdx小鼠的体内各组织分布情况
        3.2 荧光标记MOE25(PS)在H_2K mdx细胞的摄取和细胞内共定位情况
讨论
结论
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述
    综述参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]骨髓和脐血间质干细胞联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症269例疗效研究[J]. 吕乃武,杨晓凤,许忆峰,张轶斌,王红梅,吴雁翔,单鸿,崔激平,周金旭.  中国全科医学. 2010(14)
[2]应用PCR技术对4例DMD家系进行产前基因诊断[J]. 王莉,王涛,康冰,方东,廖世秀,王应太.  中华实用诊断与治疗杂志. 2010(02)
[3]经micro-dystrophin基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究[J]. 于美娟,张雅妮,冯善伟,王淑辉,熊符,张成.  临床医学工程. 2010(01)
[4]自体分选干细胞治疗15例Duchenne型肌营养不良症的临床观察[J]. 王黎明,周建军,白雯,白槟,钟占强,李建军.  中国现代医学杂志. 2010(01)
[5]成肌细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症的实验研究[J]. 刘立斌,周红雨.  中国修复重建外科杂志. 2009(10)
[6]骨髓和脐血间充质干细胞联合移植治疗杜氏型肌营养不良[J]. 杨晓凤,许忆峰,张轶斌,王红梅,吕乃武,吴雁翔,吕欣,崔激萍,单鸿,周金旭.  中国组织工程研究与临床康复. 2009(36)
[7]多重连接探针扩增方法在假肥大性肌营养不良产前基因诊断中的应用[J]. 王谦,金春莲,林长坤,崔婉婷,麻宏伟,武盈玉.  遗传. 2009(06)
[8]成肌细胞移植治疗DMD模型-mdx鼠骨骼肌Dystrophin表达的实验研究[J]. 王训,韩永升,韩咏竹,胡纪源,李凯,喻绪恩,杨任民,杨斌.  安徽医学. 2009(02)
[9]Micro-dsytrophin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理改变及micro-dystrophin的表达[J]. 王淑辉,张成,尚延昌,于美娟,张雅妮,冯善伟,李美山.  中国神经免疫学和神经病学杂志. 2008(06)
[10]产前基因检测杜氏肌营养不良[J]. 涂泽蓉,王燕,梁志清,姚宏,白云,常青.  第三军医大学学报. 2008(10)



本文编号：3275654