T细胞过继免疫治疗小鼠脑胶质瘤原位模型的研究

发布时间：2017-04-27 11:00

  本文关键词：T细胞过继免疫治疗小鼠脑胶质瘤原位模型的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：恶性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤之一,目前的主要治疗手段包括手术、放疗以及化疗,但即使这些治疗方法联合应用,胶质瘤病人的预后仍然较差。新兴的治疗方法包括免疫治疗、小分子靶向药物治疗以及基因治疗等,为胶质瘤的治疗提供了光明的前景。其中细胞免疫治疗方法近年来不断推陈出新,在各种生物治疗中表现突出。1985年Rosenberg首次应用自体淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine Activated Killer cells,LAK)治疗黑色素瘤,自此细胞免疫治疗已逐步应用于慢性白血病、肾癌以及乳腺癌等并取得一定疗效。也有研究者尝试应用该方法治疗脑胶质瘤,但由于中枢神经系统免疫的特殊性,病人的总体生存期未见明显改善,并且脑水肿等副作用也限制了其发展。近年来随着免疫学技术的不断进步及中枢神经系统免疫概念的更新,脑胶质瘤的细胞免疫治疗迎来了新的机遇。其T淋巴细胞即胸腺依赖淋巴细胞,简称T细胞。来源于骨髓多能干细胞,是重要的免疫细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居,并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环,在肿瘤的发生发展过程中,同样发挥着重要的免疫作用。T细胞过继免疫治疗近年来不断推陈出新。本研究探讨了T细胞过继免疫治疗胶质瘤的方法,即应用GL261细胞混合抗原诱导树突状细胞(Dentric Cell,DC)成熟,成熟DC体外刺激并扩增外周T细胞,将这种T细胞回输胶质瘤荷瘤鼠模型来治疗胶质瘤,并用验证其可行性和有效性,为今后细胞过继免疫治疗临床应用提供依据。目的:探究GL261脑胶质瘤细胞裂解物制备的抗原诱导的特异性T细胞对于小鼠脑胶质瘤过继免疫治疗的可行性及有效性。方法:培养GL261脑胶质瘤细胞,用反复冻融法制备GL261细胞混合抗原。在无菌环境下提取健康C57BL/6小鼠骨髓单核细胞,用鼠源性粒-巨噬细胞集落刺激因子(mouse-derived Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor,m GM-CSF)、鼠源性白介素-4(mouse-derived Interleukin-4,m IL-4)体外诱导,进而获取未成熟DC,将未成熟DC与抗原共孵育获取成熟树突状细胞。在无菌条件下取出健康C57BL/6小鼠脾脏并剪碎,用胰酶消化成单细胞悬液并裂解红细胞得到脾脏细胞悬液,用尼龙毛柱法分选脾脏细胞获取T细胞。将成熟DC与T细胞共育获取GL261胶质瘤特异性T细胞。流式细胞仪检测获取的胶质瘤特异性T细胞的增殖情况并观察胶质瘤特异性T细胞的亚群变化,MTT法检测胶质瘤特异性T细胞对GL261胶质瘤细胞的体外杀伤作用。用ALC-H型小鼠脑立体定向仪固定小鼠头颅,将GL261胶质瘤单细胞悬液注入健康C57BL/6小鼠建立GL261-C57BL/6小鼠脑胶质瘤模型,共注射16只小鼠,随机分成治疗组和对照组,每组8只。治疗组用上述胶质瘤特异性T细胞进行尾静脉注射免疫治疗,对照组尾静脉注射PBS。治疗结束后,用流式细胞仪检测小鼠外周血中T细胞亚群变化情况,并观察两组的生存期。结果:①C57BL/6小鼠骨髓单核细胞经细胞因子诱导6天后,CD11c+比例为(87±3.47)%,小鼠骨髓单核细胞可被成功诱导为未成熟DC。②未成熟DC与抗原共育18小时后,CD80、CD86表达增高(P0.05),成功获得了成熟DC。③用成熟DC刺激T细胞,72小时后T细胞分裂指数可达0.56±0.01,而用未成熟DC刺激T细胞72小时后T细胞分裂指数仅为0.28±0.02,表明成熟DC能显著促进T细胞增殖(P0.05)。④未成熟DC与T细胞共育6天后,T细胞亚群发生变化:CD8a/CD4比值为0.63±0.06,而成熟DC组为2.03±0.06(P0.05)。⑤分别按效靶比为20:1、40:1、60:1的浓度梯度进行体外杀伤实验,随着效靶比升高,T细胞对GL261胶质瘤细胞的杀伤率逐渐升高,当效靶比分别为40:1和60:1时,成熟DC诱导的GL261胶质瘤特异性T细胞杀伤率分别为(40.67±1.53)%和(62.67±2.52)%,未成熟DC组分别为(22±2.65)%和(26.33±2.08)%,成熟DC诱导的T细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用显著高于未成熟DC诱导的T细胞(P0.05)。⑥核磁共振能够证实胶质瘤原位模型接种成功。⑦T细胞治疗后小鼠外周血CD8a/CD4比值可达1.02±0.28,而对照组仅为0.69±0.09(P0.05)。⑧治疗组小鼠生存期较对照组明显延长(P0.05)。结论:GL261细胞混合抗原致敏的成熟DC能够促进T细胞增殖并提高杀伤性T细胞的比例,胶质瘤特异性T细胞在体内和体外均有较强的杀伤胶质瘤细胞作用,T细胞过继免疫治疗胶质瘤效果显著,有望进一步应用于临床。
【关键词】：T细胞 免疫治疗 胶质瘤 DC 混合抗原
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-20
• 结果20-24
• 附图24-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 综述 恶性胶质瘤的细胞过继免疫治疗研究进展42-51
• 参考文献48-51
• 致谢51-52
• 个人简历52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 花玮;姚瑜;周良辅;毛颖;肖保国;储以薇;徐锋;朱剑虹;;干细胞样抗原提高树突状细胞介导胶质瘤免疫治疗的体外研究[J];中华神经外科杂志;2009年09期

  本文关键词：T细胞过继免疫治疗小鼠脑胶质瘤原位模型的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330457