患者脑胶质瘤细胞体外3D培养及应用研究
发布时间：2021-08-23 12:57
脑胶质瘤是一种常见的中枢神经肿瘤,并且预后较差,中位生存期一般仅为12-15个月。目前,胶质瘤治疗失败的主要原因之一是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。药物体外检测模型的缺点是难以提供一个良好的肿瘤微环境,导致体外试验与体内用药结果不符,最近几年内,细胞培养正逐渐由“二维单层”迈向“三维立体”。患者衍生的三维（Three-Dimensional,3D）培养物,也可称为类器官,是一种新的体外肿瘤模型,可以更好的模拟体内肿瘤环境,有望为临床用药提供指导。在本研究中,获得了20例新鲜的神经胶质瘤肿瘤组织,包括星形细胞瘤和胶质母细胞瘤,胶质瘤组织分离出细胞后,直接在基于Matrigel的3D系统中进行培养。结果发现,来自不同患者的3D培养物表现出不同的形态特征,这可能与患者的临床特征有关,胶质母细胞瘤3D培养物的外观具有不规则的边缘和更多的突起,而星形胶质细胞3D培养物表现出相对圆形的形状。细胞3D培养一个月后,石蜡切片的苏木精伊红染色结果表明,3D培养物有一定组织形态,且与亲本组织形态结构相似保留了亲本组织的核异常性。免疫组织化学染色结果表明,3D培养物对于亲本组织的分子表达都得以维持。细胞培养...
【文章来源】：长春理工大学吉林省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细胞梯度分离示意图
第二章实验材料与方法17细胞，细胞用台盼蓝试剂染色计数。将5μLPBS中的2-4×105个细胞注射到雄性裸鼠的右侧纹状体中。（2）提前将微量进样器、剪刀等进行紫外照射20min以上，并用酒精消毒。灭菌裸鼠以4%水合氯醛（400mg/kg体量，裸鼠约200μL/只）注射腹腔麻醉，10-20min后，先固定好小鼠，接着用剪刀沿着小鼠头部矢状缝的方向将皮肤剪开，再用棉签蘸取3%H2O2擦拭颅骨使小鼠颅骨外层的结缔组织腐蚀破坏，露出颅骨，找到小鼠矢状缝和前囟点。（3）将微量进样器用夹持器固定在脑立体定位仪上（图2.2），调整其位置，使针头正好位于前囟上方，定为原点。立体定位仪显示归零：X:0.00，Y:0.00，Z:0.00。（4）将微量进样器针头从原点处向右移2.0mm，向下移1.0mm，进针深度为3.0mm，立体定位仪显示为注射位置：X:-2.00，Y:1.00，Z:-3.00。（5）静置2min,将细胞以1μL/min的速度注入小鼠脑内，然后静置3min，接着缓慢拔出针头，每拔0.5mm稍微静置（60s），3min左右完全拔出，小鼠做标记。（6）轻轻将小鼠从定位仪上取出，缝合皮肤切口，注意消毒。把鼠缓慢放到温度适合的饲养盒内，等待苏醒，第二天观察小鼠是否有伤口感染，身体状态情况。（7）后续定期小鼠称重，观察外形与精神状态。小鼠体重短期内（1-2周）骤减，有弓背现象，表明小鼠脑部可能成瘤。后续操作：1)心脏灌流并取脑，脑组织用4%PFA(表2.14)室温固定1-2天，20%蔗糖、30%蔗糖4℃梯度脱水，之后OCT包埋，冰冻切片14μm；2)处死，取脑获取肿瘤细胞（实验2.2.1），继续建立原位移植模型。图2.2小鼠胶质瘤原位模型建立示意图2.2.3细胞在Matrigel中3D培养（1）通过在两个PCR板之间轻轻按压封口膜，制作“凹窝”，得到大小相对一致的凹陷压痕模具，如下图2.3，之后紫外过夜照射，灭菌。
Matrigel 基质胶和 20%(3 μL)细胞悬液。之后，15 μL 混合液加到图 2.3 中模具的孔中，之后模具放入无菌培养皿中保护，并置于 37℃培养箱中 1 h 以固化。注意：基质胶在4℃冰箱中过夜融化，所有接触到基质胶的枪头需要预冷。 （3）将新形成的类器官转移到低粘附的 24 孔板中，并加入完全培养基（表 2.6），在不摇动的情况下培养 7 天。7 天后，将细胞转移到培养箱中的轨道振荡器上，并以60-80 RPM 振荡培养。 （4）每 3-4 天更新完全培养基，培养液更新情况由细胞生长状况决定。 （5）细胞 3D 培养 1-2 个月后，将细胞团取出，PBS 洗 1-2 次，4% PFA 固定，送去公司石蜡切片（塞维尔生物技术公司）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]骨髓间充质干细胞在Matrigel凝胶支架上的生长与变化[J]. 张斌斌,高全文,李冰,黄沙,姚斌. 中国组织工程研究. 2018(13)
本文编号：3357911
【文章来源】：长春理工大学吉林省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细胞梯度分离示意图
第二章实验材料与方法17细胞，细胞用台盼蓝试剂染色计数。将5μLPBS中的2-4×105个细胞注射到雄性裸鼠的右侧纹状体中。（2）提前将微量进样器、剪刀等进行紫外照射20min以上，并用酒精消毒。灭菌裸鼠以4%水合氯醛（400mg/kg体量，裸鼠约200μL/只）注射腹腔麻醉，10-20min后，先固定好小鼠，接着用剪刀沿着小鼠头部矢状缝的方向将皮肤剪开，再用棉签蘸取3%H2O2擦拭颅骨使小鼠颅骨外层的结缔组织腐蚀破坏，露出颅骨，找到小鼠矢状缝和前囟点。（3）将微量进样器用夹持器固定在脑立体定位仪上（图2.2），调整其位置，使针头正好位于前囟上方，定为原点。立体定位仪显示归零：X:0.00，Y:0.00，Z:0.00。（4）将微量进样器针头从原点处向右移2.0mm，向下移1.0mm，进针深度为3.0mm，立体定位仪显示为注射位置：X:-2.00，Y:1.00，Z:-3.00。（5）静置2min,将细胞以1μL/min的速度注入小鼠脑内，然后静置3min，接着缓慢拔出针头，每拔0.5mm稍微静置（60s），3min左右完全拔出，小鼠做标记。（6）轻轻将小鼠从定位仪上取出，缝合皮肤切口，注意消毒。把鼠缓慢放到温度适合的饲养盒内，等待苏醒，第二天观察小鼠是否有伤口感染，身体状态情况。（7）后续定期小鼠称重，观察外形与精神状态。小鼠体重短期内（1-2周）骤减，有弓背现象，表明小鼠脑部可能成瘤。后续操作：1)心脏灌流并取脑，脑组织用4%PFA(表2.14)室温固定1-2天，20%蔗糖、30%蔗糖4℃梯度脱水，之后OCT包埋，冰冻切片14μm；2)处死，取脑获取肿瘤细胞（实验2.2.1），继续建立原位移植模型。图2.2小鼠胶质瘤原位模型建立示意图2.2.3细胞在Matrigel中3D培养（1）通过在两个PCR板之间轻轻按压封口膜，制作“凹窝”，得到大小相对一致的凹陷压痕模具，如下图2.3，之后紫外过夜照射，灭菌。
Matrigel 基质胶和 20%(3 μL)细胞悬液。之后，15 μL 混合液加到图 2.3 中模具的孔中，之后模具放入无菌培养皿中保护，并置于 37℃培养箱中 1 h 以固化。注意：基质胶在4℃冰箱中过夜融化，所有接触到基质胶的枪头需要预冷。 （3）将新形成的类器官转移到低粘附的 24 孔板中，并加入完全培养基（表 2.6），在不摇动的情况下培养 7 天。7 天后，将细胞转移到培养箱中的轨道振荡器上，并以60-80 RPM 振荡培养。 （4）每 3-4 天更新完全培养基，培养液更新情况由细胞生长状况决定。 （5）细胞 3D 培养 1-2 个月后，将细胞团取出，PBS 洗 1-2 次，4% PFA 固定，送去公司石蜡切片（塞维尔生物技术公司）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]骨髓间充质干细胞在Matrigel凝胶支架上的生长与变化[J]. 张斌斌,高全文,李冰,黄沙,姚斌. 中国组织工程研究. 2018(13)
本文编号：3357911
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