转甲状腺素蛋白Val30Ala突变致家族型淀粉样多神经病的作用机制研究

发布时间：2021-08-24 03:20

　　家族型淀粉样多神经病（Familial amyloidotic polyneuropathy，FAP）是一种罕见的常染色体显性遗传病，与阿尔茨海默病，帕金森病等同属于淀粉样蛋白沉积疾病。临床表现为在全身组织间隙中出现淀粉样物质沉着，早期主要损伤末梢神经和植物神经，晚期可累及许多内脏器官。一般患者在症状出现后的几年到十几年内死亡。因此，FAP属于严重的致死性遗传病。葡萄牙，瑞典和日本是FAP的多发国，我国只有十几个FAP散在病例和家系的报道。转甲状腺素蛋白（Transthyretin，TTR）基因的点突变与FAP疾病密切相关。FAP患者往往可以检测到该基因某个位点的突变。目前100余种TTR基因点突变陆续被发现，其中多数与FAP发生有关，以V30M最常见。人TTR基因位于18q12.1，包含4个外显子，编译127个氨基酸组成的蛋白单体。在正常生理环境下，未发生突变的TTR结构稳定，以同源四聚体的形式在血浆中存在，其主要作用是运输甲状腺素和维生素A。TTR基因点突变往往使四聚体结构稳定性下降，解离为单体，再聚合为低聚体，最后形成淀粉样物质沉积。目前认为TTR蛋白的稳定性下降是导致该淀粉样物... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：116 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第一章 前言
    1.1 家族型淀粉样多神经病
    1.2 TTR 基因点突变是导致 FAP 的主要原因
    1.3 基因突变导致 TTR 蛋白稳定性下降形成低聚物和淀粉样纤维
    1.4 TTR 蛋白低聚物和淀粉样沉积引发细胞毒性
    1.5 FAP 疾病的治疗
    1.6 论文设计依据和研究思路
    1.7 技术路线
第二章 转甲状腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突变体的体外表达与纯化
    2.1 实验材料和仪器
        2.1.1 材料
        2.1.2 试剂
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 TTR 基因的合成
        2.2.2 pQE30-野生型 TTR 质粒构建
        2.2.3 pQE30-TTR V30M 和 pQE30-TTR V30A 质粒构建
        2.2.4 转化 pQE30-TTRs 质粒到 M15[pREP4]菌中
        2.2.5 TTRs 蛋白的表达
        2.2.6 TTRs 蛋白的 Ni 柱纯化
        2.2.7 TTRs 蛋白的透析和冻干
    2.3 实验结果
        2.3.1 PGE-TTR 和 pQE30 空载体质粒双酶切
        2.3.2 构建 PGE-TTR V30A 和 PGE-TTR V30M 质粒
        2.3.3 IPTG 诱导 TTRs 蛋白表达
        2.3.4 TTRs 蛋白的可溶性检测
        2.3.5 TTRs 蛋白的镍柱纯化
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 转甲状腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突变体体外稳定性研究
    3.1 实验材料和仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 试剂
        3.1.3 溶液配制
        3.1.4 仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 OD400nm 光密度分析
        3.2.2 ThT 荧光检测法
        3.2.4 等温微量热滴定法
        3.2.5 SDS-PAGE 电泳
        3.2.6 白藜芦醇结合分析
        3.2.7 色氨酸荧光检测
        3.2.8 圆二色谱法
        3.2.9 分子动力学模拟
        3.2.10 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 V30A 突变对 TTR 淀粉样纤维形成的影响
        3.3.2 T_4和 Flu 对 TTR 野生型和 V30A、V30M 突变体形成淀粉样沉淀的影响
        3.3.3 用等温微量热滴定法检测 Flu 与 TTRs 的结合力
        3.3.4 V30A 突变对 TTR 四级结构稳定性的影响
        3.3.5 V30A 突变对 TTR 三级结构稳定性的影响
        3.3.6 V30A 突变对 TTR 二级结构稳定性的影响
        3.3.7 TTR 野生型和 V30A，V30M 突变体的分子动力学模拟
    3.4 讨论
    3.5 小结
    3.6 工作展望
第四章 转甲状腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突变体的细胞毒作用及其作用机制
    4.1 实验材料和仪器
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 试剂
        4.1.3 溶液配制
        4.1.4 仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 IMR-32 细胞培养
        4.2.2 MTT 法
        4.2.3 台盼蓝染色法
        4.2.4 活性氧水平检测
        4.2.5 免疫蛋白印迹
        4.2.6 透射电镜
        4.2.7 统计学分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 TTRs 蛋白致 IMR-32 细胞毒性
        4.3.2 TTRs 蛋白对细胞内活性氧水平的影响
        4.3.3 TTRs 对细胞内 DNA 损伤蛋白表达水平的影响
        4.3.4 TTRs 对细胞内凋亡相关蛋白的影响
        4.3.5 TTRs 对细胞内自噬相关蛋白的影响
        4.3.6 TTRs 对热休克蛋白 HSP70 的影响
        4.3.7 V30A 突变体透射电镜形态观察
    4.4 讨论
    4.5 小结
    4.6 工作展望
结论
参考文献
攻读博士学位期间发表的文章及参加学术活动
致谢



本文编号：3359172