DRP1-Ser637去磷酸化促进多巴胺能神经元细胞线粒体自噬在咖啡因抗帕金森病中的作用研究

发布时间：2017-05-01 02:08

  本文关键词：DRP1-Ser637去磷酸化促进多巴胺能神经元细胞线粒体自噬在咖啡因抗帕金森病中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：线粒体是细胞合成能量的主要场所,线粒体维持正常的形态与功能是保证细胞进行其他生理活动的重要基础。其中,DRP1是控制线粒体断裂的关键蛋白,在维持线粒体动态平衡中起着关键作用。帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)是常见的神经退行性疾病之一,大量研究表明线粒体损伤与PD的发病密切相关。自噬是细胞 自我消化‖的一个重要途径,也是清除受损伤线粒体的有效途径。自噬过程能够顺利进行是清除损伤线粒体的重要保障。在神经细胞上,利用鱼藤酮(Rotenone)建立PD体外细胞模型是研究PD的常用细胞模型之一。Rotenone引发PD的机制与线粒体动态平衡遭到破坏,蛋白质质量控制途径缺陷以及自噬-溶酶体通路被抑制有关。有研究发现高浓度和低浓度的Rotenone在PD细胞模型中能产生不同的自噬结果。但是关于Rotenone浓度的改变与自噬发生的分子机制之间的关系目前并不清楚。据此,本研究将从线粒体动力学的角度,尤其是Rotenone对DRP1磷酸化/去磷酸化过程的影响,进一步解释Rotenone与自噬之间的关系。咖啡因(caffeine)作为具有保护神经元作用的常见的嘌呤类生物碱,流行病学调查及生物学研究已经证明摄入一定量Caffeine能够降低患有PD的风险,但是关于Caffeine降低患PD风险的机制尚未完全阐明。因此我们对Caffeine是否也能通过影响线粒体动力学来提高细胞自噬水平,从而起到缓解PD的效果进行了考察。首先,本实验采用Rotenone建立PD细胞模型,对Caffeine是否也能通过增加DRP1 Serine 637位点去磷酸化诱导线粒体自噬清除受损伤的线粒体这一机制来缓解PD进行考察。通过MTT法我们选择了10μM Rotenone作用24 h来建立PD细胞模型。本研究前期通过Western blot方法考察不同浓度Rotenone对细胞自噬水平的影响进行考察,同时检测加入自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)后细胞的自噬水平。实验结果显示3μM Rotenone作用24 h能够显著增加SH-SY5Y细胞的自噬水平。除此之外,3μM Rotenone还能够减少Ser637p-DRP1蛋白表达,即3μM Rotenone能够增加Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化过程。另外研究表明,Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化能够导致线粒体断裂水平的增加。随后我们通过激光共聚焦技术拍摄到3μM Rotenone增加的自噬小体和线粒体有良好的共定位。透射电子显微镜的结果中也能观察到自噬双层膜包裹的线粒体出现,进一步证明有线粒体自噬的发生。随后通过加入DRP1特异性抑制剂Mdivi-1和FK506,对3μM Rotenone增加的自噬与Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化以及线粒体自噬三者之间的联系进行考察。Western blot、激光共聚焦以及透射电子显微镜的共同结果显示,给予DRP1特异性抑制剂能够有效抑制DRP1的Serine 637位点去磷酸化,同时降低SH-SY5Y细胞的线粒体自噬水平,该实验结果表明3μM Rotenone可能通过促进Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化增加线粒体自噬水平。Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化可能是3μM Rotenone增加线粒体自噬水平的分子机制。其次,我们对Caffeine是否也能通过以上机制缓解PD进行考察。本研究在10μM Rotenone作用24 h建立的PD细胞模型上筛选了Caffeine的保护浓度和时间为10μM 24 h。并通过Western blot对PD的指标酪氨酸羟化酶(TH)和α-突触核蛋白(α-syn)的表达水平进行检测,结果显示10μM Rotenone能够降低TH的表达,增加α-syn的表达,给予Caffeine预保护后能够显著逆转Rotenone对TH和α-syn的影响。随后的检测结果还发现Caffeine能够对细胞的自噬水平和Ser637p-DRP1蛋白的去磷酸化水平产生与3μM Rotenone相似的结果。为了进一步验证我们的猜测,在加入Caffeine的基础上给予自噬抑制剂3-MA和DRP1特异性抑制剂FK506再次对线粒体自噬情况进行考察。Western blot及激光共聚焦的结果均显示,抑制Ser637p-DRP1去磷酸化的同时,Caffeine促进自噬水平的作用也被抑制,表明Caffeine的保护作用很有可能是通过增加Ser637p-DRP1去磷酸化诱导线粒体自噬实现的。最后,本实验以成年雄性Wistar大鼠为研究对象,应用动物行为学和高效液相色谱-电化学法考察Caffeine预处理对Rotenone诱发的PD大鼠是否具有保护作用。通过观察和记录大鼠发病率和自发活动行为的改变评价Caffeine的改善作用。实验结果显示,Rotenone组大鼠均出现不同程度的行为缺陷,且发病率(100%)明显高于Caffeine组;而Caffeine预保护组的大鼠的发病率及自发活动均得到一定程度改善。高效液相色谱-电化学检测结果显示,与Rotenone组比较,Caffeine能够显著提高大鼠纹状体内多巴胺的含量。综上所述,Caffeine能够在SH-SY5Y细胞模型和动物模型上缓解Rotenone诱导的PD,且Caffeine缓解PD的分子机制可能是通过诱导Ser637p-DRP1蛋白的去磷酸化,提高细胞线粒体自噬水平实现的。
【关键词】：帕金森 自噬 Caffeine DRP1 Ser637p-DRP1 神经保护作用
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文缩略词表9-14
• 1 前言14-31
• 1.1 帕金森氏病研究进展14-23
• 1.1.1 遗传因素14-20
• 1.1.2 环境因素20-22
• 1.1.3 Rotenone诱导的PD模型22-23
• 1.2 自噬与PD23-25
• 1.3 线粒体动力学25-28
• 1.3.1 线粒体断裂和融合的分子机制25-26
• 1.3.2 线粒体断裂与融合的调控26-27
• 1.3.3 DRP1 与PD27-28
• 1.4 Caffeine28-29
• 1.4.1 Caffeine与PD28-29
• 1.4.2 Caffeine与自噬29
• 1.5 立题依据29-31
• 2 Caffeine对Rotenone致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其对Ser637p-DRP1 去磷酸化的影响31-55
• 2.1 材料与方法32-39
• 2.1.1 主要试剂32-33
• 2.1.2 主要设备33
• 2.1.3 细胞33-34
• 2.1.4 细胞培养34
• 2.1.5 试剂的配制34-36
• 2.1.5.1 细胞培养相关试剂配制34-35
• 2.1.5.2 Western blot试验相关试剂的配制35-36
• 2.1.6 MTT法测定细胞增殖抑制率36
• 2.1.7 Western blotting检测蛋白表达36-38
• 2.1.8 质粒转染38
• 2.1.9 激光共聚焦显微镜检测线粒体自噬38-39
• 2.1.10 透射电子显微镜观察细胞的线粒体自噬结构39
• 2.1.11 数据统计与分析39
• 2.2 实验结果39-52
• 2.2.1 Rotenone能够造成SH-SY5Y细胞损伤39-40
• 2.2.2 Caffeine能够缓解Rotenone造成PD40-41
• 2.2.3 3μM Rotenone引起Ser637p-DRP1 去磷酸化及细胞自噬水平的增加41-43
• 2.2.4 Rotenone增加自噬水平与自噬抑制剂、自噬促进剂比较43-44
• 2.2.5 3μM Rotenone增加了线粒体自噬水平44-46
• 2.2.6 DRP1 不同抑制剂对Rotenone诱导的自噬水平的影响46-47
• 2.2.7 DRP1 不同抑制剂对Rotenone诱导的线粒体自噬水平的影响47-49
• 2.2.8 透射电子显微镜观察线粒体自噬的情况49
• 2.2.9 Caffeine对SH-SY5Y细胞自噬水平和DRP1 磷酸化蛋白表达的影响49-50
• 2.2.10 Caffeine对PD的缓解作用可能与Ser637p-DRP1 去磷酸化引起的细胞自噬水平增加有关50-51
• 2.2.11 Caffeine诱导线粒体自噬缓解PD51-52
• 2.3 小结与讨论52-55
• 3 Caffeine对Rotenone诱发大鼠PD模型的神经保护作用55-62
• 3.1 材料与方法55-57
• 3.1.1 主要试剂55
• 3.1.2 主要设备55-56
• 3.1.3 实验动物56
• 3.1.4 实验分组及给药56
• 3.1.5 行为学检测方法56
• 3.1.6 高效液相色谱法检测小鼠纹状体内多巴胺含量56-57
• 3.1.7 数据统计与分析57
• 3.2 实验结果57-60
• 3.2.1 Caffeine能够缓解Rotenone对大鼠的毒性作用57-58
• 3.2.2 Caffeine改善Rotenone诱发的PD模型大鼠自发活动减少58-59
• 3.2.3 Caffeine改善Rotenone诱发的PD模型小鼠纹状体多巴胺含量减少59-60
• 3.3 小结与讨论60-62
• 4 结论和展望62-64
• 4.1 结论62-63
• 4.2 创新和突破63
• 4.3 展望63-64
• 参考文献64-71
• 致谢71-73
• 在校期间发表论文73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 祁婷婷;林霖;刘芸;姜勇;;DJ-1与帕金森病[J];生物化学与生物物理进展;2011年04期

2 ;Parallel relationship between microglial activation and substantia nigra damage in a rotenone-induced Parkinson's disease rat model[J];Neural Regeneration Research;2010年04期

3 ;Mutant alpha-synuclein and autophagy in PC12 cells[J];Neural Regeneration Research;2011年02期

4 周海燕,陈生弟;Parkin,Parkin底物和帕金森病[J];生物化学与生物物理进展;2005年10期

  本文关键词：DRP1-Ser637去磷酸化促进多巴胺能神经元细胞线粒体自噬在咖啡因抗帕金森病中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：338011