真核重组质粒pCDNA3.1-FLAG-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建及分别在HEK 2
发布时间：2021-09-03 08:31
研究背景:抑癌基因PTEN（phosphatase and tension homologue deleted from chromosome 10）是位于人类第十号常染色体的基因,其表达的产物属于蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,PTP）家族,并且不同种属的PTEN基因具有高度同源性。PTEN基因是多种生物体内重要的调控因子,可参与多种细胞的增殖、分化和凋亡等环节[2]。另外最新的科学研究证据表明,PTEN基因在中枢神经系统神经元的生长分化、轴突的修复和突触可塑性等方面发挥着重要的调控作用,参与多种神经退行性疾病发病机制的重要环节。早有研究指出PTEN尤其与黑质-纹状体的多巴胺神经递质[10,11]、α-突触核蛋白毒性[12]、线粒体功能障碍[13]等机制均有关联,这为帕金森疾病发病机制、潜在基因诊断位点以及治疗靶点等方面提供了新的思路。故本研究选择构建PTEN基因多种重组质粒并纯化融合蛋白,为后续进一步研究PTEN基因序列特性、蛋白的结构生物学功能以及...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PTEN蛋白分子结构简图
真核重组质粒pCDNA3.1-FLAG-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建及分别在HEK293细胞和E.coliBL-21中的表达8第二章原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN的构建2.1实验材料2.1.2质粒pGEX-6p-1-GST：可用于构建可诱导、高水平表达的目的基因片段。该质粒全长4980bp，含有tap-lac（tac）启动子、lacI调节基因、S-D序列、lacP操纵基因、氨苄青霉素（Amp）抗性基因位点以及多克隆位点[21]。同时还含有标签蛋白谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的基因序列，微生物学实验中常常运用乳糖或类似物例如异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG）来诱导tac启动子使其在大肠杆菌感受态细胞中高水平表达出本实验需要的融合目的蛋白GST-PTEN，此外，载体质粒pGEX-6p-1-GST可以诱导表达出分子量为26KD、具有完整酶活性的GST标签蛋白，有利于GST相关融合蛋白的纯化，是为更精准的进行蛋白结构功能的研究和相关抗体的制备奠定了基矗该质粒的测序引物：5’端：-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-；3’端：-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-。图2.1pGEX-6p-1-GST质粒图谱Figure2.1pGEX-6p-1-GSTplasmidmapPTEN：种属是人类。根据基因库中查询到人PTEN基因编码多肽氨基酸序列(AF067844.1)，为江苏大学附属医院中心实验室储存。
收集管中。13）将上一步收集管中洗脱溶液用移液枪轻轻吸出来再重新加入吸附膜正中心，重复步骤 12，所得质粒溶液运用紫外光光度计测定质粒的浓度和纯度，并做好标记，随后于 -20 ℃冰箱保存备用。14）双酶切的质粒溶液经琼脂糖凝胶电泳分析阳性者送上海生物工程公司测序。2.3 实验结果2.3.1 以 HEK 293 细胞中提取总 RNA 逆转录的 c DNA 为模板、原核目的基因片段上下游引物经 PCR 扩增产物经 1％琼脂糖凝胶电泳后在 162 bp 处看到目的片段，符合预期值。
【参考文献】：
期刊论文
[1]帕金森病流行现状[J]. 刘疏影,陈彪. 中国现代神经疾病杂志. 2016(02)
[2]PTEN inhibition and axon regeneration and neural repair[J]. Yosuke Ohtake,Umar Hayat,Shuxin Li. Neural Regeneration Research. 2015(09)
本文编号：3380780
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PTEN蛋白分子结构简图
真核重组质粒pCDNA3.1-FLAG-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建及分别在HEK293细胞和E.coliBL-21中的表达8第二章原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN的构建2.1实验材料2.1.2质粒pGEX-6p-1-GST：可用于构建可诱导、高水平表达的目的基因片段。该质粒全长4980bp，含有tap-lac（tac）启动子、lacI调节基因、S-D序列、lacP操纵基因、氨苄青霉素（Amp）抗性基因位点以及多克隆位点[21]。同时还含有标签蛋白谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的基因序列，微生物学实验中常常运用乳糖或类似物例如异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG）来诱导tac启动子使其在大肠杆菌感受态细胞中高水平表达出本实验需要的融合目的蛋白GST-PTEN，此外，载体质粒pGEX-6p-1-GST可以诱导表达出分子量为26KD、具有完整酶活性的GST标签蛋白，有利于GST相关融合蛋白的纯化，是为更精准的进行蛋白结构功能的研究和相关抗体的制备奠定了基矗该质粒的测序引物：5’端：-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-；3’端：-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-。图2.1pGEX-6p-1-GST质粒图谱Figure2.1pGEX-6p-1-GSTplasmidmapPTEN：种属是人类。根据基因库中查询到人PTEN基因编码多肽氨基酸序列(AF067844.1)，为江苏大学附属医院中心实验室储存。
收集管中。13）将上一步收集管中洗脱溶液用移液枪轻轻吸出来再重新加入吸附膜正中心，重复步骤 12，所得质粒溶液运用紫外光光度计测定质粒的浓度和纯度，并做好标记，随后于 -20 ℃冰箱保存备用。14）双酶切的质粒溶液经琼脂糖凝胶电泳分析阳性者送上海生物工程公司测序。2.3 实验结果2.3.1 以 HEK 293 细胞中提取总 RNA 逆转录的 c DNA 为模板、原核目的基因片段上下游引物经 PCR 扩增产物经 1％琼脂糖凝胶电泳后在 162 bp 处看到目的片段，符合预期值。
【参考文献】：
期刊论文
[1]帕金森病流行现状[J]. 刘疏影,陈彪. 中国现代神经疾病杂志. 2016(02)
[2]PTEN inhibition and axon regeneration and neural repair[J]. Yosuke Ohtake,Umar Hayat,Shuxin Li. Neural Regeneration Research. 2015(09)
本文编号：3380780
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/3380780.html
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