化学遗传学靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响及机制研究

发布时间：2021-09-04 12:05

　　全球每年大约有200万人罹患自发性脑内出血（spontaneous cerebral hemorrhage,ICH）,具有死亡率和致残率高的特点,并且目前治疗措施效果不佳。因此,寻找脑出血治疗的新策略和新靶点具有重要的科学意义和临床价值。所谓化学遗传学技术（designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs）,是利用遗传学方法,利用化学小分子作为工具解决生物的问题,或者通过干扰、调控正常生理过程,以达到了解蛋白质功能,是利用化学工具进行探索和研究生命过程的一门新兴学科。相关研究表明,刺激大脑皮层可能会促进脑卒中的康复,但是相关的机制目前尚不明确,在本文中,我们将利用腺相关病毒转染使小鼠运动皮层表达hM3D（Gq）,并结合腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO）,进而特异性激活运动皮层中的谷氨酸能神经元,探讨运动皮层的谷氨酸能神经元在脑出血小鼠的恢复过程中的作用及可能机制。本论文开展的研究如下:首先,本文将能够靶向谷氨酸能神经元的腺相关病毒载体,利用立体定向技术构建化学遗传学小鼠动物模型。饲养3周待病毒载体稳定... 

【文章来源】：河北医科大学河北省

【文章页数】：150 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

本研究总体时间轴及化学遗传学和脑出血动物模型构建模式图

一共两孔。DREADDs病毒工具注射的第1孔和第2孔分别位于矢状缝右侧前后两个临近靶点。脑立体定位病毒注射部位冠状位示意图。化学遗传学病毒工具立体定向注射至右侧运动皮层M1区前后相邻的两个位置。

为了研究被化学遗传学AAV病毒工具转染的小鼠运动皮层谷氨酸能神经元的激活情况,我们取30只乳鼠分别注射对照溶剂(Vehicle组)、真病毒pAAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq-mCherry(hM3Dq组)和假病毒pAAV2/9-CaMKIIα-mCherry(mCherry组)分别注射到不同分组的8只乳鼠中。病毒注射后21天,从存活的乳鼠中各选取6只,进行后续化学遗传学工具运动皮层转染和活性鉴定实验。取材、切片荧光显微镜观察病毒表达情况,使用免疫组化检测c-Fos在大脑运动皮层的表达水平验证化学遗传学工具对运动皮层谷氨酸能神经元的激活。结果显示:通过免疫荧光验证被化学遗传学工具稳定转染的运动皮层谷氨酸能神经元;腹腔注射CNO后,免疫组化检测发现hM3Dq组即早基因c-Fos表达较mCherry组和Vehicle组明显增高(见表1.4,图1.5D,*P<0.05),证实了运动皮层谷氨酸能神经元的兴奋性增高,从而证实化学遗传学技术可以通过局部注射化学遗传学工具联合腹腔注射其配体CNO激活皮层谷氨酸能神经元。通过本部分研究可以验证化学遗传学工具能够特异性调控运动皮层谷氨酸能神经元的兴奋性(如图1.5)。免疫组化显示运动皮层c-Fos的表达情况。(A)hM3Dq组化学遗传学病毒注射靶点的免疫组化显示,联合腹腔注射CNO后即早基因c-Fos表达水平较mCherry(B)和Vehicle组(C)明显升高。标尺为20um。对运动皮层M1区c-Fos表达的神经元数量计数(B)表明hM3Dq组较其它两组c-Fos表达神经元数量显著升高(P<0.01),数据显示为均数±SEM。


本文编号：3383232