探讨一种新型Wnt替代蛋白激活脑细胞Wnt信号通路的作用研究

发布时间：2021-09-04 13:02

　　目的本文旨在探讨一种新型Wnt替代蛋白（Wnt surrogate,Wnt-S）对大脑中多种细胞Wnt/β-catenin信号通路的作用,以及可能治疗脑卒中的一种新的策略。方法合成Wnt-S片段,利用分子克隆的方法将此片段与载体pcDNA3.1（+）连接,再与大肠杆菌作转化,铺平板,挑单克隆,摇菌提取质粒,用PEI转染法将质粒与HEK 293F细胞进行瞬时转染,取上清然后纯化Wnt-S蛋白,蛋白免疫印迹（Western blot）检测含6x His标签的Wnt-S蛋白,并在HEK 293细胞中进行活性验证。培养HEK 293,hCMEC/D3,HBVP,HA,HOC,NSC,BV2,Neuron,采用免疫荧光染色的方法分别检测这些细胞特异的标志物,实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）分别检测这些细胞中受体FZD1-10（Frizzled家族）、LRP5/6以及相应标志物的表达情况。用Wnt-S蛋白分别处理这些细胞,实时荧光定量PCR检测Wnt/β-catenin信号通路靶基因Axin2的表达情况。小鼠脑定位SGZ区注入Wnt-S腺病毒,检测神经干细... 

【文章来源】：锦州医科大学辽宁省

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

（A/B）Wnt-SinpUC57-Kan和Wnt-SinpcDNA3.1(+)双酶切核酸电泳图

说明转染后第 5 天应当停止培养 293 F 细胞（此时细胞活度不应低于 70%），收集上清（图2A）。依次用 20-160mM 咪唑洗脱镍柱填料中的 Wnt-S 蛋白，根据 GE Healthcare公司说明书的建议（该填料有高特异性的 His 标签蛋白吸附能力，40mM 咪唑即可洗脱较高纯度的目的蛋白），结合我们的 Western blot 实验结果，我们选择60mM 咪唑洗脱后的蛋白溶液，得到纯度更高的 Wnt-S 蛋白（图 2B）。即 Wnt-S表达纯化的最佳条件为转染后第 5 天收集上清，60mM 咪唑洗脱镍柱，并浓缩蛋白溶液。

图 I: Neuron，神经元细胞标志物 MAP-2 高表达图 3（A-I） 免疫荧光染色四、FZD1-10,LRP5/6 和相应 Marker 的表达水平人胚胎肾细胞 293 中 FZD3,6,7 高表达，FZD1,2,4,5 和 Lrp6 表达较


本文编号：3383314