EMX2基因突变及KIF17在癲痫中的作用和机制研究
发布时间：2021-09-09 13:34
第一部分EMX2基因突变（c.478G>T）影响癫痫易感性的机制研究背景癫痫是神经系统疾病中一种严重危害人类健康的常见病、多发病,遗传因素是癫痫的病因之一。课题组前期应用基因捕获测序技术在全面性发作的癫痫家系中发现了EMX2基因的错义突变（c.478G>T）,导致第160号氨基酸由丙氨酸（Ala）变为丝氨酸（Ser）（p.Ala160Ser）,该变异可能导致蛋白质功能受到影响。EMX2基因在神经系统发育过程中扮演了非常重要的角色,其突变可能致使神经系统发育紊乱而诱发异常神经网络活动参与癫痫的发生发展。目的探讨EMX2错义突变（c.478G>T）对癫痫易感性的影响及可能机制。方法本研究主要采用分子生物学、原代神经元培养、鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔建立脑内基因转染模型、CRISPR/Cas9技术构建条件性基因敲入小鼠模型、Cre重组酶腺相关病毒海马立体定位注射、戊四氮慢性点燃癫痫行为学筛查以及染色质免疫共沉淀-测序等方法。基因克隆技术分别构建野生型质粒EMX2（160Ala）和突变型质粒EMX2重庆医科大学博士研究生学位论文（160Ser）,通过转染HEK293细胞,免疫荧...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
家系癫痫患者基因测序图及先证者发作期脑电图
图 1.2：不同类型质粒的表达验证Figure 1.2: Verification of the expression of different types of plasmids..3 突变型与野生型 EMX2 蛋白亚细胞定位情况由于人 EMX2 编码区的第 478 号核苷酸 G 变为了 T，导致第 160 号氨基酸氨酸（Ala）突变为了丝氨酸（Ser），众所周知，Ala 是不能被磷酸化的，而可以被磷酸化的，故这种突变可能导致 EMX2 蛋白翻译后修饰的改变，使其胞定位和稳定性发生变化，我们使用免疫荧光的方法进行了亚细胞定位检测过在 HEK293 细胞中分别转染带 Flag 标签的 Human-N-Flag-EMX2（160Alautant-N-Flag-EMX2（160Ser）和 Mouse-N-Flag-Emx2（161Ala）质粒，48 h 后固定、通透、封闭、染色和封片，荧光显微镜观察拍照。如图 1.3 所示，Flag-EM红色）与 DAPI（蓝色）共定位，三组之间没有差异，提示各种 Flag-EMX2 都定位，其亚细胞定位并没有发生改变。
图 1.3：不同类型 EMX2 的亚细胞定位情况Figure 1.3: Subcellular localization of wild-type and mutant EMX2.突变型与野生型 EMX2 细胞蛋白降解检测情况如前所述，我们猜测该突变（p.Ala160Ser）是否可能会影响 EMX2 蛋白？于是，我们采用放线菌酮实验来检测不同类型 EMX2 蛋白的降解情况 HEK293 细胞中分别转染野生型 PCAG-N-Flag-EMX2（160Ala）和突G-N-Flag-EMX2（160Ser）的质粒（每组平行转染四个 3.5 cm 的小皿）， 后加入放线菌酮（抑制蛋白合成），在加药后的 0，4，12，24 h 分别进行取并行免疫印迹荧光检测标签 Flag 信号（绿色），a-tubulin（红色）为上如图 1.4 所示，Flag 绿色信号从 0-24 h 都没有明显衰减，提示野生型 0Ala）和突变型 EMX2（160Ser）的稳定性并没有差异。
【参考文献】：
期刊论文
[1]锂-匹罗卡品致痫大鼠脑组织中驱动蛋白家族成员17的表达情况[J]. 于岫楠,周雪颖,李新钢,周盛年. 中华神经科杂志. 2013 (08)
本文编号：3392187
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
家系癫痫患者基因测序图及先证者发作期脑电图
图 1.2：不同类型质粒的表达验证Figure 1.2: Verification of the expression of different types of plasmids..3 突变型与野生型 EMX2 蛋白亚细胞定位情况由于人 EMX2 编码区的第 478 号核苷酸 G 变为了 T，导致第 160 号氨基酸氨酸（Ala）突变为了丝氨酸（Ser），众所周知，Ala 是不能被磷酸化的，而可以被磷酸化的，故这种突变可能导致 EMX2 蛋白翻译后修饰的改变，使其胞定位和稳定性发生变化，我们使用免疫荧光的方法进行了亚细胞定位检测过在 HEK293 细胞中分别转染带 Flag 标签的 Human-N-Flag-EMX2（160Alautant-N-Flag-EMX2（160Ser）和 Mouse-N-Flag-Emx2（161Ala）质粒，48 h 后固定、通透、封闭、染色和封片，荧光显微镜观察拍照。如图 1.3 所示，Flag-EM红色）与 DAPI（蓝色）共定位，三组之间没有差异，提示各种 Flag-EMX2 都定位，其亚细胞定位并没有发生改变。
图 1.3：不同类型 EMX2 的亚细胞定位情况Figure 1.3: Subcellular localization of wild-type and mutant EMX2.突变型与野生型 EMX2 细胞蛋白降解检测情况如前所述，我们猜测该突变（p.Ala160Ser）是否可能会影响 EMX2 蛋白？于是，我们采用放线菌酮实验来检测不同类型 EMX2 蛋白的降解情况 HEK293 细胞中分别转染野生型 PCAG-N-Flag-EMX2（160Ala）和突G-N-Flag-EMX2（160Ser）的质粒（每组平行转染四个 3.5 cm 的小皿）， 后加入放线菌酮（抑制蛋白合成），在加药后的 0，4，12，24 h 分别进行取并行免疫印迹荧光检测标签 Flag 信号（绿色），a-tubulin（红色）为上如图 1.4 所示，Flag 绿色信号从 0-24 h 都没有明显衰减，提示野生型 0Ala）和突变型 EMX2（160Ser）的稳定性并没有差异。
【参考文献】：
期刊论文
[1]锂-匹罗卡品致痫大鼠脑组织中驱动蛋白家族成员17的表达情况[J]. 于岫楠,周雪颖,李新钢,周盛年. 中华神经科杂志. 2013 (08)
本文编号：3392187
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