Notch信号途径在胶质瘤发病机制中的作用研究

发布时间：2021-09-12 14:54

　　胶质瘤是中枢神经系统最常见，致死率最高的恶性肿瘤，具有高度的异型性、较强的侵袭能力及对放化疗抵抗的特点，死亡率高居颅脑疾病的第二位。由于其发病机制尚不完全清楚，因此，目前仍缺乏针对胶质瘤有效的治疗方法，恶性程度最高的胶质瘤中位生存期只有14.6个月，5年生存率仅为9.8%，因此，探索针对胶质瘤的有效治疗方法是神经外科学界亟待解决的医学难题，而通过胶质瘤致病机制的研究有望为胶质瘤的治疗提供新的辅助治疗手段。近年的多项研究证实，胶质瘤中存在一群数量少但较特殊的细胞，这群细胞具有干细胞特征，被称为胶质瘤干细胞（Glioma stem cells，GSCSs），这些细胞具有如下特点：可快速增殖，具有多向分化的潜能、容易体外成瘤、对放化疗不敏感。研究认为，这群细胞的存在是胶质瘤治疗效果差和容易复发的主要原因。因此除了目前常规针对非胶质瘤干细胞的联合治疗手段外，研究调控GSCs的关键分子和主要的信号通路，寻找靶向消除GSCs的有效治疗方法可为胶质瘤的治疗提供新的辅助治疗手段。Notch信号途径在进化上高度保守，在细胞增殖、分化、命运决定方面有着非常重要作用。研究表明，Notch信号途径在胶质瘤中处... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略语表
中文摘要
Abstract
前言
文献回顾
    第一部分 胶质瘤与胶质瘤干细胞
    第二部分 NOTCH 信号通路
    第三部分 MICRORNAS（微 RNAS，MIRNAS）
第一部分 FHL1A 在胶质瘤中低表达及其对胶质瘤增殖的抑制作用
    实验一：FHL1A 在胶质瘤中的表达分析
        1 材料
            1.1 胶质瘤标本来源
            1.2 主要试剂
            1.3 常用缓冲液
            1.4 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 Western Blot
            2.2 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）
        3 结果
            3.1 FHL1 在胶质瘤中的表达低于相应瘤周正常脑组织
            3.2 在胶质瘤中的表达与胶质瘤级别及预后相关
        4 讨论
    实验二、FHL1A 可抑制胶质瘤的增殖
        1 材料
            1.1 细胞来源
            1.2 主要试剂
            1.3 常用缓冲液系统
            1.4 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 Western blot
            2.2 流式细胞技术进行细胞周期分析
            2.3 MTT 法观察细胞的增殖
            2.4 FHL1A 过表达及干涉慢病毒载体的构建
            2.5 FHL1A 过表达及干涉慢病毒载体包装
            2.6 慢病毒感染稳转细胞系的构建
        3 结果
            3.1 FHL1A 在 U251 中有表达，而在 U87 中则无表达
            3.2 构建了 U87 过表达 FHL1A 及 U251 干涉 FHLA 的稳转细胞系
            3.3 FHL1A 可抑制胶质瘤细胞系的增殖（MTT 法）
            3.4 FHL1A 可抑制胶质瘤细胞系的增殖（流式细胞仪检测）
        4 讨论
    实验三、FHL1A 通过抑制 PI3K/AKT 信号通路抑制胶质瘤增殖
        1 材料
            1.1 细胞来源
            1.2 主要试剂
            1.3 常用缓冲液系统
            1.4 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 Western blot
            2.2 流式细胞技术进行细胞周期分析
            2.3 MTT 法观察细胞的增殖
        3 结果
            3.1 过表达 FHL1A 可抑制 AKT 的磷酸化，而抑制 FHL1A 可促进其磷酸化
            3.2 PI3K/AKT 通路特异性抑制剂 LY294002 抑制剂可抑制 FHL1A 对 U251 增殖的促进作用（MTT 法）
            3.3 3.3 PI3K/AKT 通路特异性抑制剂 LY294002 抑制剂可抑制 FHL1A 对U251 增殖的促进作用（流式细胞仪检测细胞周期）
        4 讨论
第二部分 MICRORNA-342-5P 调控胶质瘤干细胞增殖及分化作用研究
    实验一、microRNA-342-5p 在胶质瘤中的表达及其与级别的关系
        1 材料
            1.1 胶质瘤标本来源
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 胶质瘤标本 RNA 的提取，定量及反转录
            2.2 miR-342-5p 分子表达的检测
        3 结果
            3.1 miRNA 的芯片结果由本实验室提供
            3.2 miR-342-5p 在胶质瘤中的表达低于相应瘤周正常脑组织
            3.3 miR-342-5p 的表达与胶质瘤级别呈负相关关系
        4 讨论
    实验二 胶质瘤干细胞（GSCSs）的原代培养及鉴定
        1 材料
            1.1 细胞来源
            1.2 主要试剂
            1.3 常用配置试剂和培养液
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 胶质瘤样品的获取
            2.2 GSCs 的原代培养
            2.3 GSCs 的分化培养
            2.4 免疫荧光染色
            2.5 用于 GSCs 培养的胶质瘤患者临床资料
        3 结果
            3.1 GSCs 克隆球原代培养及鉴定
            3.2 GSCs 多向分化潜能及免疫荧光鉴定
            3.3 胶质瘤病人资料的整理收集
        4 讨论
    实验三 miR-342-5p 在胶质瘤干细胞与非干细胞表达差异及 Notch 信号通路对miR-342-5p 表达的调控
        1 材料
            1.1 细胞来源
            1.2 主要试剂
            1.3 常用配置试剂和培养液
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 胶质瘤干细胞及非干细胞 RNA 的提取，定量及反转录
            2.2 实时定量 PCR
            2.3 原代 GSCs 培养
            2.4 原代普通胶质瘤细胞的培养
        3 结果
            3.1 miR-342-5p 及 Notch 信号途径效应分子 Hes1、Hes5 在胶质瘤干细胞与非干细胞表达差异
            3.2 Notch 信号途径可抑制胶质瘤干细胞中 miR-342-5p 的表达
        4 讨论
    实验四 miR-342-5p 对 GSCSs 生物学功能的影响
        1 材料
            1.1 细胞来源
            1.2 主要试剂
            1.3 缓冲液和培养基
            1.4 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 GSCs 的原代培养
            2.2 细胞转染
            2.3 miR-342-5p 对 GSCs 增殖能力影响的观察
            2.4 miR-342-5p 对 GSCs 分化影响的观察
            2.5 反转录及实时定量 PCR
            2.6 免疫荧光染色
        3 结果
            3.1 miR-342-5p 可抑制 GSCs 的分化（光镜观察）
            3.2 miR-342-5p 可抑制 GSCs 的增殖（免疫荧光结果）
            3.3 miR-342-5p 可抑制 GSCs 的分化（免疫荧光结果）
            3.4 miR-342-5p 可抑制 GSCs 的分化（实时定量 PCR）
        4 讨论
    实验五 miR-342-5p 通过癌基因 Pokemon 影响 GSCSs 的生物学功能
        1 材料
            1.1 细胞来源
            1.2 主要试剂
        2 方法
            2.1 pokemon3’UTR 区 pGL3 promoter 报告基因载体的构建
            2.2 pcDNA6.2-miR-342-5p 载体的构建
            2.3 细胞转染
            2.4 报告基因检测
            2.5 细胞 RNA 的提取，定量，反转录
            2.6 细胞蛋白提取，定量，westernblot
        3 结果
            3.1 miR-342-5p 下游靶基因的预测
            3.2 miR-342-5p 对 pokemon（ZBTB-7A）的调控作用
        4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Pokemon蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J]. 赵智宏,王胜发,张铁娃.  中国肺癌杂志. 2007(06)
[2]Isolation and Identification of Cancer Stem-Like Cells from Murine Melanoma Cell Lines[J]. Jun Dou 1,4, ,Meng Pan 1,2,4 ,Ping Wen 1 ,Yating Li 1 ,Quan Tang 1 ,Lili Chu 1 ,Fengshu Zhao 1 , Chuilian Jiang 1 ,Weihua Hu 1 ,Kai Hu 1 and Ning Gu 3,1Department of Pathogenic Biology and Immunology,School of Basic Medical Science,Southeast University,Nanjing 210009,China; 2Jiangsu Province Hospital,Nanjing 210029,China; 3 Biological Science of Medical Engineering,Southeast University,Nanjing 210096,China; 4These authors contributed equally to the study;.  Cellular & Molecular Immunology. 2007(06)
[3]Detection of tumor stem cell markers in pancreatic carcinoma cell lines[J]. Monika Olempska,Patricia Alice Eisenach,Ole Ammerpohl,Hendrik Ungefroren,Fred Fandrich,Holger Kalthoff.  Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2007(01)



本文编号：3394429