MRTF-A调控PAX7介导的肌肉再生及其机制研究

发布时间：2021-10-11 12:05

　　背景:肌肉萎缩是一种严重危害人类健康的疾病,目前尚无有效的治疗措施。由肌肉干细胞介导的肌肉再生被认为是肌肉组织功能重建的重要途径,配对盒7（Paired box 7,PAX7）是肌肉干细胞,即肌肉卫星细胞的标志基因,在卫星细胞增殖和自我更新过程中发挥了至关重要的作用。然而,PAX7参与卫星细胞调控的分子机制尚不十分明确。我们前期研究发现MRTF-A在卫星细胞中高表达,本研究在此基础上,旨在探讨MRTF-A调控PAX7的表达,进而影响肌肉细胞增殖和自我更新过程的分子机制,为肌肉萎缩的临床防治提供新思路。方法:在小鼠组织中提取卫星细胞并通过流式、免疫荧光等方法鉴定;利用慢病毒技术筛选稳定过表达/敲降MRTF-A成肌细胞C2C12细胞系,通过RT-qPCR、Western blot检测卫星细胞及稳定过表达/敲降MRTF-A的C2C12细胞系中MRTF-A和PAX7及下游增殖分化相关基因的表达情况;通过免疫荧光、MTT、EdU、流式细胞技术等实验检测过表达和敲降MRTF-A对小鼠成肌细胞的增殖、凋亡以及自我更新的影响;通过RT-qPCR和Western blot检测在增殖和分化阶段MRTF-A... 

【文章来源】：武汉科技大学湖北省

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 前言
第2章 实验材料
    2.1 实验菌种与细胞株
    2.2 实验组织样品
    2.3 实验仪器
    2.4 实验试剂
第3章 实验方法
    3.1 细胞培养
    3.2 卫星细胞分离
    3.3 流式细胞技术
    3.4 RT-qPCR
    3.5 损伤模型的构建
    3.6 H&E染色
    3.7 Western blot
    3.8 组织切片的免疫组化
    3.9 构建重组载体
        3.9.1 构建重组质粒
        3.9.2 转化
        3.9.3 质粒小提
        3.9.4 质粒中提
    3.10 慢病毒包装
    3.11 EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)细胞标记测定
    3.12 CCK-8
    3.13 细胞免疫荧光
    3.14 荧光素酶活性
    3.15 EMSA
        3.15.1 核蛋白提取
        3.15.2 EMSA实验
    3.16 ChIP
第4章 实验结果
    4.1 研究MRTF-A和 PAX7 在肌肉细胞中的表达情况
        4.1.1 卫星细胞的分离及鉴定
        4.1.2 检测MRTF-A和 PAX7 在肌肉细胞增殖分化中的表达变化
    4.2 探究MRTF-A和 PAX7 在小鼠肌肉再生中的作用
        4.2.1 H&E染色检测CTX损伤模型小鼠的肌肉再生情况
        4.2.2 RT-qPCR检测MRTF-A和 PAX7 在肌肉再生过程中的表达
        4.2.3 Western blot和免疫组化检测MRTF-A和 PAX7 在肌肉再生中的表达
    4.3 证明MRTF-A调控肌肉细胞的增殖和自我更新
        4.3.1 干扰/过表达MRTF-A稳转细胞系的筛选及验证
        4.3.2 MRTF-A对肌肉细胞的增殖的影响
        4.3.3 MRTF-A对肌肉细胞的自我更新的影响
        4.3.4 MRTF-A对肌肉细胞的凋亡的影响
    4.4 证明MRTF-A通过影响PAX7 基因的表达进而参与肌肉再生
        4.4.1 检测CTX损伤小鼠肌肉再生过程中相关基因的表达情况
        4.4.2 检测干扰/过表达MRTF-A对 PAX7 及下游基因的影响
    4.5 证明MRTF-A对 PAX7 基因的调控依赖其启动子区的CarG box元件
        4.5.1 PAX7 启动子区截短以及定点突变报告载体的构建
        4.5.2 双荧光素酶报告系统检测MRTF-A对 PAX7 启动子报告基因活性的影响
        4.5.3 通过EMSA和 ChIP检测MRTF-A对 PAX7 启动子区CarG box的结合
第5章 结论
第6章 讨论与展望
致谢
参考文献
附录1 攻读硕士学位期间发表的论文
附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目



本文编号：3430475