Foxo1-KLF2-S1P1及相关分子在重症肌无力患者胸腺表达的研究

发布时间：2017-05-04 07:09

  本文关键词：Foxo1-KLF2-S1P1及相关分子在重症肌无力患者胸腺表达的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是由乙酰胆碱受体抗体(Acetylcholine Receptor antibody,n ACh R-Ab)介导,细胞免疫依赖和补体参与的神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)神经递质传递障碍的一种自体免疫性疾病。文献报道显示重症肌无力患者胸腺上皮细胞存在骨骼肌的共同抗原(n ACh R),该抗原能够致敏T细胞继而激活B细胞,产生抗n ACh R的抗体(Ach R-Ab)。约70%--80%的重症肌无力病人胸腺异常(胸腺瘤、胸腺肥大及淋巴滤泡增生等),在胸腺中已检出Ach R亚单位m RNA,重症肌无力患者胸腺源性T细胞及B细胞对Ach R应答较外周血同类细胞强,且有显著的T细胞功能异常。在切除胸腺后病情得到了改善,提示了胸腺在MG的发病中有着重要的作用。胸腺是T细胞分化发育成熟的场所,大量的体液免疫研究已经表明了n ACh R作为重症肌无力的靶分子所遭到的损害,是由n Ach R-Ab介导的:而n Ach R-Ab对n ACh R的免疫应答则是需要依赖T细胞的,T细胞在MG自身免疫中起到了关键性的作用,但T细胞在胸腺的分化过程还存在着许多问题有待研究。T细胞的发育是一个高度有序且多阶段的过程,在不同的发育阶段需要依赖于胸腺微环境所提供的各种不同的信号。对于成熟单阳性胸腺细胞如何迁出胸腺的这一问题,近年来有研究显示,S1P1介导的信号在调节成熟单阳性胸腺细胞的输出中有着重要的作用,提示S1P1在单阳性胸腺细胞表达是成熟T细胞从胸腺输出进入外周的关键分子。这在S1P1基因缺陷小鼠胸腺细胞分化和迁出实验中得到证实,但在人类胸腺细胞分化、迁出中的作用尚未得到证实,这为我们研究重症肌无力的发病机制提供了一个切入点。本研究对比分析S1P1及其上游分子Foxo1、KLF2在重症肌无力胸腺和正常对照胸腺表达的差异,探讨Foxo1-KLF2-S1P1在重症肌无力患者胸腺成熟T细胞输出中的作用,分析其与疾病发生的关系。方法收集郑州大学第二附属医院胸外科经临床确认手术切除的15例重症肌无力患者胸腺(病理类型均为胸腺增生型),设定为MG组;15例非自身免疫先天性心脏病行开胸手术者胸腺,设定为正常对照组。1.Foxo1、KLF2、S1P1及CD62L、CCR7、CD69的m RNA的检测:提取MG患者组及正常对照胸腺组织的总RNA,通过荧光定量RT-PCR检测Foxo1、KLF2、S1P1及CD62L、CCR7、CD69的m RNA表达水平,采用2-△△Ct法在MG患者组和正常对照组之间进行相对定量;2.Foxo1、S1P1及CD62L、CCR7、CD69分子在胸腺细胞的表达:制作胸腺组织切片,通过免疫组织化学技术了解Foxo1、S1P1、CD62L、CD69、CCR7在胸腺组织的分布与表达;3.Foxo1及S1P1蛋白的定量分析:提取胸腺组织蛋白,通过Western blot定量检测比较Foxo1和S1P1蛋白水平表达有无差异。4.血清中S1P水平的检测:通过ELISA法检测比较MG患者和正常对照组血清中S1P的水平。5.统计学分析:应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料数据用均数±标准差(SX±)表示,两组均数的比较用t检验,当p0.05时认为差异有统计学意义。结果1.Foxo1、KLF2、S1P1及CD62L、CCR7、CD69 m RNA在胸腺的表达:实时定量RT-PCR结果显示,与正常胸腺相比Foxo1及其下游分子KLF2、S1P1、CCR7、CD69在重症肌无力患者胸腺中的表达显著增高(p0.05),CD62L表达无差异。2.Foxo1、S1P1及CD62L、CCR7、CD69分子在胸腺细胞的表达:免疫组织化学结果表明,Foxo1、S1P1、CCR7在MG患者及对照组胸腺都有表达,主要分布在髓质区,MG患者胸腺组织髓质区扩大,Foxo1、S1P1、CCR7阳性细胞数明显多于正常对照组胸腺组织(p0.05)。3.Foxo1及S1P1蛋白定量分析:Western blot结果表明,Foxo1和S1P1蛋白在MG患者及对照组胸腺中都有表达;与正常对照相比,MG患者胸腺中Foxo1和S1P1蛋白表达水平明显增高(p0.05)。4.血清S1P的含量:ELISA结果显示,在MG患者和正常对照组的外周血中,S1P的浓度未见显著差异(p0.05)。结论MG患者胸腺组织Foxo1及其下游分子KLF2、S1P1的表达显著高于正常胸腺;MG患者Foxo1-KLF2-S1P1信号轴的高表达可能是MG患者胸腺细胞的异常输出的原因。
【关键词】：重症肌无力 胸腺 T细胞 Foxo1 KLF2 S1P1
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R746.1
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 中英文缩略词对照表13-14
• 1 前言14-16
• 2 材料和方法16-31
• 2.1 材料16-19
• 2.1.1 研究对象16
• 2.1.2 主要试剂16-17
• 2.1.3 主要实验仪器17-19
• 2.2 实验方法19-31
• 2.2.1 主要溶液的配置19-20
• 2.2.2 qRT-PCR检测基因mRNA表达水平20-25
• 2.2.3 免疫组织化学检测蛋白分布表达25-26
• 2.2.4 Western blot检测蛋白表达26-29
• 2.2.5 ELISA检测S1P在人外周血含量29-30
• 2.2.6 统计学分析30-31
• 3 结果31-38
• 3.1 MG患者与对照组胸腺组织中Foxo1、KLF2、S1P1、CD62L、 CCR7、CD69 的mRNA表达水平31-33
• 3.1.1 目的基因和内参的标准曲线制定31-32
• 3.1.2 Foxo1、KLF2、S1P1、CD62L、CCR7、CD69 的扩增结果32-33
• 3.2 MG患者与对照组胸腺组织中Foxo1、S1P1、CCR7、CD69 和CD62L分子的分布与表达33-35
• 3.2.1 Foxo1，S1P1，CCR7 在MG患者和对照胸腺组织中的分布表达33-34
• 3.2.2 CD62L 在 MG 患者和对照胸腺组织中的分布表达34
• 3.2.3 CD69 在MG胸腺和正常胸腺组织的表达34-35
• 3.3 Western blot检测MG患者与对照组胸腺组织中Foxo1 和S1P1蛋白表达水平35-36
• 3.4 ELISA测定MG患者与对照组血清中S1P浓度水平36-38
• 3.4.1 根据实验测得的标准品数据绘制标准曲线36
• 3.4.2 两组之间比较血清中S1P浓度水平36-38
• 4 讨论38-41
• 4.1 Foxo1-KLF2-S1P1 在MG组和正常对照组中的表达39
• 4.2 转录因子Foxo1 下游分子在MG组和正常对照组中的表达39-40
• 4.3 MG组和正常对照组的外周血中S1P浓度水平40-41
• 5 小结41-42
• 参考文献42-46
• 综述 T细胞在胸腺的发育分化过程46-65
• 参考文献58-65
• 个人简历65-66
• 致谢66

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本文编号：344612