瑞舒伐他汀预处理对局灶性缺血再灌注大鼠自噬水平的影响

发布时间：2017-05-07 11:15

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【摘要】：目的脑卒中是目前全球长期致残的主要原因之一,也是导致城镇居民死亡的第三位因素。据统计,85%～90%的发病人群为缺血性卒中,缺血再灌注损伤是致残和致死的主要原因。近年来研究表明,除了炎症及氧化应激反应,过度激活的自噬也参与了IRI的病理进程。临床研究结果也显示抑制过度激活的自噬反应可以缓解脑缺血再灌注损伤、发挥神经保护作用。他汀类药物作为临床推荐神经保护剂取得了广泛运用,研究者在心脏缺血再灌注损伤模型中发现,该类药物不仅具有抗炎及抗氧化应激的作用,还可以调节细胞自噬水平。瑞舒伐他汀是经典他汀类药物之一,属于选择性HMG-CoA还原酶抑制剂,具有半衰期长、体内血药浓度高等优点。研究表明,瑞舒伐他汀预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经具有保护作用,其机制可能与抑制神经细胞凋亡和局部炎性反应有关。然而,细胞自噬是否参与了脑缺血再灌注损伤的神经系统损伤机制,以及该病理过程是否受到瑞舒伐他汀的调控,国内研究尚为空白。本研究采用栓线法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)局灶性急性脑缺血再灌注大鼠模型,观察脑缺血再灌注损伤过程中缺血半暗带神经元及神经胶质细胞病理形态及自噬水平的变化；并选择瑞舒伐他汀作为神经保护剂,分析瑞舒伐他汀预处理是否也可以通过调节自噬水平发挥神经保护作用,为进一步完善其潜在的神经保护机制提供数据支撑。方法1局灶性急性脑缺血再灌注大鼠模型的制备选取健康成年雄性SD大鼠75只,随机分为空白对照组、假手术组、MCAO模型组、瑞舒伐他汀预处理组和溶剂组5组,各组15只。空白对照组正常饲养；MCAO模型组、瑞舒伐他汀预处理组和溶剂组采用栓线法建立MCAO局灶性急性脑缺血再灌注大鼠模型,栓塞时长90 min；假手术组仅给予颈部皮肤切开和颈总动脉游离系线处理,不进行栓塞。除此之外,瑞舒伐他汀预处理组和溶剂组分别于模型制备前(缺血前)30min腹腔注射瑞舒伐他汀和二甲基亚砜(DMSO)。90min后拔出线栓,即完成缺血后再灌注模型制备。采用改良神经损伤严重程度评分(mNSS)标准对各组大鼠进行神经行为学评分,评价模型制备成功率。2缺血半暗带神经元及神经胶质细胞形态观察缺血再灌注(拔出线栓)90min后,采用TTC染色法测定脑梗死面积,电镜下观察缺血半暗带内神经元及神经胶质细胞形态和自噬泡数量。3细胞自噬激活定位和水平测定采用免疫荧光双标实验,观察LC-3B与NeuN、LC-3B与GFAP、LC-3B与Iba-1的双标图像,确定自噬激活位置是在神经元内还是胶质细胞内。采用免疫蛋白印迹(Western Blot)实验检测脑缺血半暗带区域自噬体膜蛋白微管相关蛋白1轻链3A、3B (LC-3A, LC-3B)及前自噬体膜蛋白Beclinl的表达量。4数据统计学分析采用医学统计学软件SPSS19.0进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,多组之间的比较行单因素方差分析,期间任意两组之间的比较行LSD-t检验；计数资料以构成比或百分比表示,行卡方检验；等级资料行秩和检验；P0.05表明差异有统计学意义。结果1模型评价空白对照组和假手术组未出现神经功能损害症状,mNSS评分均为0;MCAO模型组、瑞舒伐他汀预处理组和溶剂组均出现明显的神经功能损害症状,mNSS平均分分别为(11.2±1.26)分、(10.9±1.12)分、(11.44±1.31)分,其组间的mNSS评分有统计学差异,瑞舒伐他汀预处理组明显低于其他两组(P0.05)。2缺血半暗带神经元及神经胶质细胞形态TTC染色后,脑梗死区域呈现苍白色,非脑梗死区域呈现红色,苍白色区域与大脑中动脉供血区域一致。就梗死面积而言,瑞舒伐他汀预处理组较MCAO模型组和溶剂组小,且差异有统计学意义（P0.05); MCAO模型组和溶剂组之间无统计学差异(P0.05)。此外,瑞舒伐他汀预处理组凋亡细胞和自噬泡数量较MCAO模型组和溶剂组少,且差异有统计学意义(P0.05); MCAO模型组和溶剂组之间无统计学差异(P0.05)。3细胞自噬激活定位和水平免疫荧光共聚焦显微镜下,LC-3B为绿色荧光,NeuN为红色荧光,缺血半暗带区域呈现绿色荧光和红色荧光重叠色-橙色,说明LC-3B主要定位于神经元细胞。Western blot实验结果显示,MCAO模型组、瑞舒伐他汀预处理组和溶剂组的LC-3A, LC-3B及Beclin1蛋白表达水平明显高于空白对照组和假手术组(P0.05),空白对照组和假手术组之间无统计学差异(P0.05)；瑞舒伐他汀预处理组的LC-3A, LC-3B及Beclin1蛋白表达水平明显低于MCAO模型组和溶剂组(P0.05), MCAO模型组和溶剂组之间无统计学差异(P0.05)。结论1缺血缺氧性损伤能够促进缺血半暗区自噬泡和自噬溶酶体的形成,启动自噬反应,且存在细胞自噬和细胞凋亡共存的特点。2自噬因子LC主要表达于神经元,星形胶质细胞及小胶质细胞也有少量分布,合理调控三种神经细胞的自噬转导通路,均有可能起到神经保护作用。3半暗区自噬因子LC-3A、LC-3B及Beclin1的表达上调,瑞舒伐他汀能够下调LC-3A、LC-3B及Beclin1的表达,抑制神经细胞自噬,从而发挥神经保护作用,可能为其治疗缺血再灌注损伤的重要机制之一。
【关键词】：瑞舒伐他汀 MCAO大鼠模型 脑缺血再灌注损伤 自噬 细胞凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-26
• 结果26-36
• 讨论36-48
• 结论48-49
• 参考文献49-59
• 致谢59-60
• 学位论文评阅及答辩情况表60

【参考文献】

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本文编号：349767