siRNA干扰Notch1对神经元样PC12细胞缺血损伤作用机制研究

发布时间：2022-04-20 20:51

　　缺血性脑血管病是神经内科临床最常见的神经系统疾病，缺血性脑损伤是其重要的病理及病理生理过程。近年来，细胞信号转导通路参与缺血性脑损伤与修复的机制研究已受到广泛关注，越来越多的信号通路被发现可参与脑缺血损伤过程。Notch1信号通路是一个在进化过程中高度保守的信号转导通路。有研究表明，Notch1信号可调控动脉生成、参与缺血脑损伤后神经元新生过程[1]。但Notch1信号通路在缺血性脑损伤过程中的变化及其作用机制尚不清楚。本研究在体外建立脑缺血损伤模型，探讨Notch1信号通路在脑缺血损伤中作用及机制，为进一步揭示Notch1信号转导通路与脑缺血损伤的联系和内在机制研究奠定实验基础，为脑缺血损伤的治疗提供理论依据和可能的治疗靶点。1. PC12细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及其氧糖剥夺模型的制备目的：体外培养PC12细胞，诱导其转化为神经元样细胞，行氧糖剥夺（OGD），建立体外脑缺血损伤模型。方法：体外培养PC12细胞，NGF（终浓度150ng/ml）刺激诱导其分化为神经元样细胞，应用无糖培养基及缺氧培养箱行OGD；应用MTT、流式细胞术及免疫荧光染色法行模型评价。结果：终浓度150... 

【文章页数】：87 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第1章 绪论
第2章 综述
    1.MAPK 信号转导通路
    2.JAK/STAT 信号通路
    3.PI3K/Akt 信号通路
    4.NF-κB 信号通路
    5.Rho/Rho-kinase 信号转导通路
    6.ActA/Smads 信号通路
    7. PKA-CREB 信号转导通路
    8.Toll 样受体 4 信号转导通路
    9.Notch 信号通路
    10.结语
第3章 PC12 细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及氧糖剥夺模型的制备
    3.1 材料
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 PC12 细胞培养
        3.2.2 PC12 细胞转化为神经元样细胞的培养
        3.2.3 PC12 细胞转化为神经元的鉴定
        3.2.4 PC12 细胞氧糖剥夺模型（OGD）的建立
        3.2.5 PC12 细胞氧糖剥夺模型评价
        3.2.6 统计学处理
    3.3 实验结果
        3.3.1 NGF 诱导 PC12 细胞转化为神经元样细胞的培养
        3.3.2 PC12 细胞转化为神经元样细胞的的鉴定
        3.3.3 PC-12 细胞氧糖剥夺（OGD）模型的建立
        3.3.4 PC-12 细胞氧糖剥夺（OGD）模型的评价
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 靶向沉默 Notch1 基因及沉默效果检测
    4.1 材料
        4.1.1 细胞株
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 PC12 细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及分组
        4.2.2 Notch1-siRNA 靶点的选择、设计及合成
        4.2.3 细胞转染
        4.2.4 转染效率检测
        4.2.5 Realtime-PCR 检测 Notch1 mRNA 表达
        4.2.6 Western blot 检测 Notch1 蛋白表达
        4.2.7 转染毒性检测
        4.2.8 siRNA 最佳作用浓度的筛选
        4.2.9 siRNA 最佳作用时间的筛选
        4.2.10 统计学处理
    4.3 结果
        4.3.1 转染效率检测
        4.3.2 沉默效果检测
        4.3.3 转染毒性检测
        4.3.4 Notch1-siRNA 最佳浓度的筛选
        4.3.5 Notch1-siRNA 最佳作用时间的筛选
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 Notch1 信号通路在神经元样 PC12 细胞 OGD 损伤后表达变化及 Notch1-siRNA 对其影响
    5.1 材料
        5.1.1 细胞株
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 PC12 细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定、OGD 模型制备及分组
        5.2.2 细胞转染
        5.2.3 Realtime-PCR 检测 Notch1mRNA 表达
        5.2.4 Western blot 检测 Notch1 及 NICD 蛋白表达
        5.2.5 统计学处理
    5.5 结果
        5.5.1 Realtime-PCR 检测 Notch1 mRNA 表达
        5.5.2 Western blot 检测 Notch1 及 NICD 蛋白表达
    5.6 讨论
    5.7 小结
第6章 Notch1-siRNA 对神经元样 PC12 细胞缺血性损伤的影响及机制
    6.1 材料
        6.1.1 细胞株
        6.1.2 主要试剂
        6.1.3 主要仪器
    6.2 实验方法
        6.2.1 PC12 细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定、OGD 模型制备及分组
        6.2.2 细胞转染
        6.2.3 细胞凋亡检测
        6.2.4 Realtime-PCR 检测 IAP-1 和 Caspase-3 mRNA 表达
        6.2.5 Western blot 检测 IAP-1 和 Caspase-3 蛋白表达
        6.2.6 统计学处理
    6.3 结果
        6.3.1 FCM 检测细胞凋亡率
        6.3.2 Realtime-PCR 检测 IAP-1 和 Caspase-3mRNA 表达
        6.3.3 Western-blot 检测 IAP-1 和 Caspase-3 蛋白表达
    6.4 讨论
    6.5 小结
参考文献
结论
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Caspase Family Proteases and Apoptosis[J]. Ting-Jun FAN Li-Hui HAN Ri-Shan CONG Jin LIANG College of Marine Life Sciences,Division of Life Science and Technology,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;College of Chemistry & Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(11)
[2]Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway[J]. Tyler ZARUBIN.  Cell Research. 2005(01)



本文编号：3646641