超低频经颅磁刺激对局部脑缺血再灌注损伤大鼠海马区内源性神经干细胞的影响

发布时间：2017-05-14 13:11

  本文关键词：超低频经颅磁刺激对局部脑缺血再灌注损伤大鼠海马区内源性神经干细胞的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[背景]脑血管疾病由于其高患病率、高致死率和高致残率,是威胁人类健康的一类重要疾病,给社会、家庭带来了沉重的负担。传统的观点认为中枢神经系统(central never system, CNS)损伤后,神经功能的缺失是永久性的,不能恢复。但大量的研究表明,缺血缺氧损伤后相邻及远隔区域会出现细胞坏死和凋亡,并发广泛迟发性脑缺血伴脑血流量下降；同时也可以激活少量的内源性神经干细胞(neural stem cells, NSCs),使其发生增殖、迁移、分化及整合,以修复受损的组织。越来越多的证据表明CNS具有潜在的自我修复能力,主要是因为在侧脑室下区(SVZ)、海马齿状回颗粒下层(SGZ)、大脑皮质、第四脑室和脊髓中央管等部位存在可以向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的神经干细胞。在多种病变或某些因素刺激下这些NSCs可被激活,增殖后,在某些趋化因子的引导下迁移向损伤部位,并发生分化与整合,但是新生干细胞的数量和存活时间有限,且主要形成胶质瘢痕,不能良好的修复受损神经组织。不同部位的神经干细胞对不同的病变或损伤,激活情况不同。海马齿状回是NSCs主要存在的区域之一,而且对脑卒中和神经退行性变等神经损伤反应较为敏感,如缺血再灌注损伤未直接作用于海马,但病理检查发现海马区明显的细胞改变,并有明显的神经再生。脑损伤后,存在较多影响NSCs激活、增殖的因素,如年龄、细胞因子、神经递质等。巢蛋白(nestin)是原始神经组织表达的一种中间丝结构蛋白,主要定位于细胞质。nestin主要在未分化、具有分裂能力的细胞表达,其表达与干细胞成熟的终末分化过程相一致。因此,我们将nestin视为神经干细胞或神经前提细胞的标志之一,用于NSCs的鉴定。而5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)是一种胸腺嘧啶核苷酸类似物,在细胞增殖周期嵌入细胞核DNA中,从而标记新生细胞,我们将Brdu阳性细胞视为新增殖的细胞。重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)技术是利用电磁感应原理,将脉冲磁场作用于脑部,通过改变刺激频率使皮层神经细胞的膜电位发生变化,使之产生感应电流,影响脑内代谢和神经电活动,从而导致CNS变化的磁刺激技术。rTMS被广泛应用于人类脑生理功能如运动、视觉、语言等和疾病状态下脑的病理生理改变等的研究。近年来rTMS在治疗脑损伤疾病如帕金森病、抑郁、脑血管疾病等和精神类疾病如抑郁、焦虑、失眠等取得了良好的效果。有研究证实,采用rTMS治疗缺血性脑卒中,可明显改善病人包括精细动作等的运动功能、看图识物能力、命名能力及语言表达能力。刺激频率不同,rTMS对CNS的作用不同,高频(1Hz)刺激可以增加局部皮质的兴奋性和血流量,相反,低频(≤1Hz)刺激可以降低皮质兴奋性和血流量。rTMS为多脉冲磁场,而超低频磁刺激(ultra-low-frequency transcranial magnetic stimulation,ULF-TMS)刺激频率0.2Hz,为连续磁场。ULF-TMS可通过干预神经递质的活性影响脑的功能,具有特殊的生物物理特性及临床应用价值。随着ULF-TMS应用领域的不断拓宽,其治疗机制的问题也日益受到人们的重视。目前的许多研究提示rTMS治疗CNS疾病可能通过影响NSCs而发挥作用,如rTMS可促进海马齿状回BDNF,5-HT的表达,而BDNF,5-HT则是NSCs的正性调节因子；rTMS可引起脑内微环境的变化,而微环境则是影响NSCs的重要因素。ULF-TMS的连续磁场可在脑区产生超低频电流,进而模拟多种神经递质的慢突触后电位的作用。施加的ULF-TMS频率不同,可分别影响兴奋性神经递质和抑制性神经递质,1mHzULF-TMS与抑制性神经递质γ-GABA的活动有关,11mHzULF-TMS则对应兴奋性神经递质多巴胺(DA)。本实验比较1mHz、11mHz频率的ULF-TMS与10Hz的rTMS对NSCs的影响,研究不同频率的ULF-TMS在不同的时间点对局部脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经运动功能恢复的作用及对模型大鼠海马区内源性神经干细胞激活、增殖的影响。[目的]本实验通过比较2种ULF-TMS与10Hz的rTMS对内源性神经干细胞的影响,研究不同频率的ULF-TMS在不同的时间点对局部脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经运动功能恢复的作用以及对模型大鼠海马区内源性神经干细胞激活、增殖的影响。[方法]1、线栓法制备SD大鼠左侧缺血再灌注损伤模型。将造模成功的大鼠随机分配到1mHz 7天组、1mHz 14天组、1mHz 21天组,11mHz 7天组、11mHz 14天组、11mHz 21天组,10Hz 7天组、10Hz 14天组、10Hz 21天组及假刺激7天组、假刺激14天组、假刺激21天组；另手术制备假手术组。2、1 mHz组、11mHz组分别给予频率为1 mHz、11 mHz的ULF-TMS; lOHz组施加频率为10Hz的rTMS;刺激强度均为500 Gs,每次15 min,1次/d；假刺激组同样放置磁刺激仪,但不给予磁刺激,余处理同磁刺激组；假手术组自然饲养。3、各组大鼠在处死前24小时腹腔注射Brdu。4、分别在第7天、第14天及第21天应用18分制神经功能障碍评分方法对各组大鼠进行神经功能评定。5、将评分后的模型大鼠处死后取脑,置4%多聚甲醛中后固定过夜,之后石蜡包埋,行连续冠状位切片,取切片分别行HE染色及免疫组化SABC法检测nestin及Brdu的表达水平；Western Blot检测各组大鼠不同时间点海马区nestin蛋白表达水平。[统计学方法]胶片用扫描仪将图像输入电脑,利用Image-Pro Plus软件测定免疫组化nestin阳性及BrdU阳性表达的平均光密度；Image-Pro Plus图像分析软件测定nestin和内参GAPDH条带平均灰度值,nestin蛋白相对表达量用两者的比值表示。应用SPSS16.0统计软件,计数结果均以(X±S)表示,组间比较采用单因素方差分析,P0.05为差异有统计学意义,进一步行两两比较(LSD法),以P0.05为差异有显著性意义。[结果]1、假手术组在不同时间点,神经行为学评分未见明显变化,且均高于假刺激组及磁刺激组；第7天,神经行为学评分三组磁刺激组与假刺激组无明显统计学差异；在14天、21天,1mHz ULF-TMS组、11mHz ULF-TMS组和10Hz rTMS组评分均高于假刺激组；但10Hz组评分较高,与1mHz、11mHz评分有差异；1mHz与11mHz相比则无明显统计学差异。2、磁刺激组及假刺激组大鼠海马部位均可见到estin阳性的细胞,阳性物质呈棕黄色,主要沉积在胞浆；在7天、14天、21天,假刺激组nestin平均光密度均高于假手术组；在三个时间点,3组磁刺激组nestin平均光密度较假刺激组明显增高；但10Hz组与1mHz、11mHz有差异,其值较高；1mHz与11mHz相比则无明显统计学差异。3、Brdu阳性细胞呈棕黄色,阳性物质主要沉积在胞核；不同时间点假手术组Brdu阳性平均光密度明显低于磁刺激组及假刺激组；在第7天、14天、21天,10Hz组与1mHz组、11mHz组、假刺激组相比,Brdu阳性平均光密度增多；1mHz组、11mHz组和假刺激组之间3个时间点均无显著性差异。4、Western蛋白印迹显示假手术组nestin蛋白几乎无表达；10Hz组与1mHz组、11mHz组nestin蛋白表达均较假刺激组明显增多；10Hz组表达的nestin蛋白在不同时间点与1mHz组、11mHz组相比有显著性差异,10Hz组表达较多；1mHz与11mHz之间表达差异不明显。[结论]1、1mHz ULF-TMS、11mHz ULF-TMS和10Hz的rTMS均可促进局部脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经运动功能的恢复；但在不同时间点,1mHz ULF-TMS、 11mH zULF-TMS与10Hz的rTMS对促进神经运动恢复的程度不同。2、局部脑缺血再灌注损伤可引起模型大鼠海马区NSCs的激活和增殖。3、1mHz ULF-TMS、11mHz ULF-TMS和10Hz的rTMS在7天、14天及21天均可刺激模型大鼠海马区NSCs的激活；但是不同频率的磁刺激对促进模型大鼠海马区nestin表达的程度不同。4、10Hz的rTMS可促进局部脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马区NSCs的增殖；但1mHz ULF-TMS、11mHz ULF-TMS对促进模型大鼠海马区NSCs增殖的作用尚未观察到。
【关键词】：内源性神经干细胞 超低频磁刺激 经颅磁刺激 局部脑缺血再灌注损伤
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 中英文简写对照表15-16
• 第一章 研究背景16-25
• 第一节 内源性神经干细胞的研究进展16-20
• 第二节 重复经颅磁刺激的研究进展20-25
• 第二章 实验部分25-48
• 第一节 试剂和仪器25-26
• 第二节 对象和方法26-34
• 第三节 结果34-41
• 第四节 讨论41-47
• 第五节 结论47-48
• 参考文献48-56
• 攻读学位期间成果56-57
• 附录 综述57-67
• 参考文献63-67
• 致谢67-68

【参考文献】

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1 顾平;张忠霞;马芹颖;耿媛;王彦永;张丽娜;王铭维;;经颅磁刺激帕金森病模型小鼠体内神经干细胞的增殖[J];中国组织工程研究;2013年45期

  本文关键词：超低频经颅磁刺激对局部脑缺血再灌注损伤大鼠海马区内源性神经干细胞的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：365258